304 neoksidebla ŝtalo bobeno-tuba kemia komponento, La strukturo de la ektodomajno PACA6 enhavas konservitan superfamilion de proteinoj asociitaj kun gametfuzio.

Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Glitiloj montrante tri artikolojn per diapozitivo.Uzu la malantaŭan kaj sekvan butonojn por moviĝi tra la lumbildoj, aŭ la butonojn de glit-regiloj ĉe la fino por moviĝi tra ĉiu lumbildo.

SPACA6 estas sperm-esprimita surfacproteino kiu estas kritika por gametfuzio dum mamula seksa reproduktado.Malgraŭ tiu fundamenta rolo, la specifa funkcio de PACA6 estas nebone komprenita.Ni klarigas la kristalan strukturon de la eksterĉela domajno de SPACA6 je rezolucio de 2.2 Å, rivelante du-domajnan proteinon kunmetitan de kvar-fadena pakaĵo kaj Ig-similaj β-sandviĉoj kunigitaj per kvazaŭ-flekseblaj ligiloj.Tiu strukturo similas IZUMO1, alian gamet-fuzio-rilatan proteinon, igante SPACA6 kaj IZUMO1 fondi membrojn de la superfamilio de fekundigo-rilataj proteinoj referitaj ĉi tie kiel la IST-superfamilio.La IST-superfamilio estas strukture difinita per sia tordita kvar-helica fasko kaj paro de disulfid-ligitaj CXXC-ĉeftemoj.Struktur-bazita AlphaFold serĉo de la homa proteomo identigis kromajn proteinmembrojn de tiu superfamilio;precipe, multaj el tiuj proteinoj estas implikitaj en gametfuzio.La SPACA6-strukturo kaj ĝia rilato al aliaj membroj de la IST-superfamilio disponigas la mankantan ligon en nia scio pri mamula gametfuzio.
Ĉiu homa vivo komenciĝas per du apartaj haploidaj gametoj: la spermo de la patro kaj la ovo de la patrino.Ĉi tiu spermo estas la gajnanto de intensa selektprocezo dum kiu milionoj da spermoĉeloj trapasas la inan genitalan vojon, venkas diversajn obstaklojn1 kaj spertas kapaciĝon, kiu plibonigas ilian motilecon kaj la procezon de surfacaj komponantoj2,3,4.Eĉ se la spermo kaj ovocito trovas unu la alian, la procezo ankoraŭ ne finiĝis.La ovocito estas ĉirkaŭita de tavolo de kumulĉeloj kaj glikoproteinbariero nomita la zona pellucida, tra kiu spermo devas pasi por eniri la ociton.Spermatozooj uzas kombinaĵon de surfacaj adheraj molekuloj kaj membran-rilataj kaj kaŝitaj enzimoj por venki ĉi tiujn finajn barojn5.Tiuj molekuloj kaj enzimoj estas ĉefe stokitaj en la interna membrano kaj akrosoma matrico kaj estas detektitaj kiam la ekstera membrano de la spermo estas lizita dum la akrosoma reago6.La fina paŝo en ĉi tiu intensa vojaĝo estas la evento de fuzio spermo-ovo, en kiu la du ĉeloj kunfandas siajn membranojn por iĝi ununura diploida organismo7.Kvankam ĉi tiu procezo estas pionira en homa reproduktado, la necesaj molekulaj interagoj estas nebone komprenitaj.
Aldone al la fekundigo de gametoj, la kemio de la fuzio de du lipidbitavoloj estis grandskale studita.Ĝenerale, membranfandado estas energie malfavora procezo, kiu postulas proteinan katalizilon sperti strukturan formoŝanĝon, kiu proksimigas du membranojn, rompante ilian kontinuecon kaj kaŭzante fuzion8,9.Ĉi tiuj proteinaj kataliziloj estas konataj kiel fusogens kaj estis trovitaj en sennombraj fuziosistemoj.Ili estas postulataj por viruseniro en gastigajn ĉelojn (ekz., gp160 en HIV-1, piko en koronavirusoj, hemaglutinino en gripaj virusoj)10,11,12 placenta (sincitino)13,14,15 kaj gamet-formaj fuzioj en malsuperaj eŭkariotoj ( HAP2/GCS1 en plantoj, protistoj kaj artropodoj) 16,17,18,19.Fuzogenoj por homaj gametoj ankoraŭ devas esti malkovritaj, kvankam pluraj proteinoj pruviĝis esti kritikaj por gametligo kaj fuzio.La oci-esprimita CD9, transmembrana proteino necesa por la fuzio de muso kaj homaj gametoj, estis la unua estanta malkovrita 21,22,23.Kvankam ĝia preciza funkcio restas neklara, rolo en adhero, la strukturo de adheraj fokusoj sur ovomikroviloj, kaj/aŭ la ĝusta lokalizo de ocitaj surfacproteinoj ŝajnas verŝajne 24,25,26.La du plej tipaj proteinoj kiuj estas kritikaj por gametfuzio estas la spermproteino IZUMO127 kaj la ocitproteino JUNO28, kaj ilia reciproka unuiĝo estas grava paŝo en gametrekono kaj adhero antaŭ fuzio.Masklaj Izumo1 knokaŭtaj musoj kaj inaj Junoaj knokaŭtaj musoj estas tute sterilaj, en ĉi tiuj modeloj spermo eniras la perivitelan spacon sed gametoj ne kunfandiĝas.Simile, kunfluejo estis reduktita kiam gametoj estis traktitaj kun anti-IZUMO1 aŭ JUNO27,29 antikorpoj en homaj en vitro fekundigo eksperimentoj.
Lastatempe, lastatempe malkovrita grupo de sperm-esprimitaj proteinoj fenotipe similaj al IZUMO1 kaj JUNO20,30,31,32,33,34,35 estis malkovrita.Sperma akrosoma membran-rilata proteino 6 (SPACA6) estis identigita kiel esenca por fekundigo en grandskala murina mutagenezstudo.Enmeto de la transgeno en la genon Spaca6 produktas nefandeblajn spermatozoojn, kvankam tiuj spermatozooj infiltras la perivitelan spacon 36 .Postaj knokaŭtaj studoj ĉe musoj konfirmis, ke Spaca6 estas postulata por gametfuzio 30,32.SPACA6 estas esprimita preskaŭ ekskluzive en la testikoj kaj havas lokalizpadronon similan al tiu de IZUMO1, nome ene de la intimo de la spermatozooj antaŭ la akrosomal reago, kaj tiam migras al la ekvatora regiono post la akrosomal reago 30,32.Spaca6 homologoj ekzistas en gamo da mamuloj kaj aliaj eŭkariotoj 30 kaj ĝia graveco por homa gametfuzio estis pruvita per inhibicio de homa fekundigo en vitro per rezisto al SPACA6 30 .Male al IZUMO1 kaj JUNO, la detaloj de la strukturo, interagoj, kaj funkcio de PACA6 restas neklaraj.
Por pli bone kompreni la fundamentan procezon sub la kunfandiĝo de homa spermo kaj ovoj, kiu ebligos al ni informi estontajn evoluojn en familia planado kaj fekundeca traktado, ni faris SPACA6-strukturajn kaj biokemiajn studojn.La kristalstrukturo de la eksterĉela domajno de SPACA6 montras kvar-helikforman faskon (4HB) kaj imunglobulin-similan (Ig-similan) domajnon ligitan per kvazaŭ-flekseblaj regionoj.Kiel antaŭdirite en antaŭaj studoj,7,32,37 la domajna strukturo de SPACA6 estas simila al tiu de homa IZUMO1, kaj la du proteinoj dividas nekutiman ĉeftemon: 4HB kun triangula helikforma surfaco kaj paro de disulfid-ligitaj CXXC-ĉeftemoj.Ni proponas, ke IZUMO1 kaj SPACA6 nun difinas pli grandan, strukture rilatan superfamilion de proteinoj asociitaj kun gametfuzio.Uzante trajtojn unikajn al la superfamilio, ni faris ĝisfundan serĉon por la AlphaFold struktura homa proteomo, identigante pliajn membrojn de ĉi tiu superfamilio, inkluzive de pluraj membroj implikitaj en gameta fuzio kaj/aŭ fekundigo.Nun ŝajnas, ke ekzistas ofta struktura faldo kaj superfamilio de proteinoj asociitaj kun gametfuzio, kaj nia strukturo disponigas molekulan mapon de tiu grava aspekto de la homa gameta fuziomekanismo.
SPACA6 estas unu-enirpermesila transmembranproteino kun unu N-ligita glicano kaj ses supozaj disulfidobligacioj (Figures S1a kaj S2).Ni esprimis la eksterĉelan domajnon de homa SPACA6 (restaĵoj 27-246) en Drosophila S2-ĉeloj kaj purigis la proteinon per nikel-afineco, katjona interŝanĝo kaj grandeco-ekskluda kromatografio (Fig. S1b).La purigita PACA6-ektodomajno estas tre stabila kaj homogena.Analizo uzanta grandekskludan kromatografion kombinitan kun plurlatera malpeza disvastigo (SEC-MALS) malkaŝis unu pinton kun kalkulita molekula pezo de 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Tio estas kongrua kun la grandeco de la SPACA6 monomera ektodomajno, indikante ke oligomerigo ne okazis dum purigado.Krome, cirkla dikroisma (KD) spektroskopio rivelis miksitan α/β-strukturon kun frostopunkto de 51.3 °C (Fig. S1d, e).Dekonvolucio de la KD-spektroj rivelis 38.6% α-helikformajn kaj 15.8% β-senhelpajn elementojn (Figuro S1d).
La ektodomajno SPACA6 estis kristaligita per hazarda matrica semado38 rezultigante datuman aron kun rezolucio de 2.2 Å (Tablo 1 kaj Figuro S3).Uzante kombinaĵon de fragment-bazita molekula anstataŭigo kaj SAD-fazdatumoj kun bromida ekspozicio por strukturdetermino (Tabelo 1 kaj Figuro S4), la fina rafinita modelo konsistas el restaĵoj 27-246.Tiutempe la strukturo estis determinita, ekzistis neniuj eksperimentaj aŭ AlphaFold-strukturoj haveblaj.La ektodomajno SPACA6 mezuras 20 Å × 20 Å × 85 Å, konsistas el sep helicoj kaj naŭ β-fadenoj, kaj havas longforman terciaran faldon stabiligitan per ses disulfidaj ligoj (Fig. 1a, b).La malforta elektrondenseco ĉe la fino de la Asn243 flankĉeno indikas ke tiu restaĵo estas N-ligita glikozilado.La strukturo konsistas el du domajnoj: N-fina kvar-helica pakaĵo (4HB) kaj C-fina Ig-simila domajno kun meza ĉarnira regiono inter ili (Fig. 1c).
Strukturo de la eksterĉela domajno de PACA6.Striodiagramo de la eksterĉela domajno de SPACA6, la koloro de la ĉeno de N ĝis C-finaĵo de malhelblua ĝis malhelruĝa.Cisteinoj implikitaj en disulfidobligacioj estas elstarigitaj en magento.b Topologio de la eksterĉela domajno de SPACA6.Uzu la saman kolorskemon kiel en Figuro 1a.c SPANA6 eksterĉela domajno.La 4HB, ĉarniro, kaj Ig-simila domajna striodiagramo estas koloritaj oranĝaj, verdaj kaj bluaj, respektive.La tavoloj ne estas desegnitaj al skalo.
La 4HB-domajno de SPACA6 inkluzivas kvar ĉefajn helicojn (helicojn 1-4), kiuj estas aranĝitaj en formo de helikforma helico (Fig. 2a), alternante inter kontraŭparalelaj kaj paralelaj interagoj (Fig. 2b).Malgranda kroma unuturna helico (helico 1′) estas metita perpendikulare al la pakaĵo, formante triangulon kun helicoj 1 kaj 2. Tiu triangulo estas iomete misformita en la helikforma tordita pakado de la relative densa pakado de helicoj 3 kaj 4 ( Fig. 2a).
4HB N-fina striodiagramo.b Supra vido de fasko de kvar helicoj, ĉiu helico elstarigita en malhelblua ĉe la N-finaĵo kaj malhelruĝa ĉe la C-finaĵo.c Desupra spirala radodiagramo por 4HB, kun ĉiu restaĵo montrita kiel cirklo etikedita kun unulitera aminoacida kodo;nur la kvar aminoacidoj ĉe la supro de la rado estas numeritaj.Ne-polusaj restaĵoj estas kolorigitaj flavaj, polusaj neŝarĝitaj restaĵoj estas kolorigitaj verdaj, pozitive ŝargitaj restaĵoj estas kolorigitaj bluaj, kaj negative ŝargitaj restaĵoj estas kolorigitaj ruĝe.d Triangulaj edroj de la 4HB-domajno, kun 4HBs en oranĝo kaj ĉarniroj en verda.Ambaŭ enigaĵoj montras bastonformajn disulfidligojn.
4HB estas koncentrita sur interna hidrofoba kerno kunmetita ĉefe de alifataj kaj aromaj restaĵoj (Fig. 2c).La kerno enhavas disulfidligon inter Cys41 kaj Cys55 kiu ligas helicojn 1 kaj 2 kune en supra levita triangulo (Fig. 2d).Du pliaj disulfidaj ligoj estis formitaj inter la CXXC-ĉeftemo en Helix 1′ kaj alia CXXC-motivo trovita ĉe la pinto de la β-harpinglo en la ĉarnira regiono (Fig. 2d).Konservativa argininrestaĵo kun nekonata funkcio (Arg37) situas ene de kava triangulo formita de helicoj 1′, 1, kaj 2. Alifataj karbonatomoj Cβ, Cγ, kaj Cδ Arg37 interagas kun la hidrofoba kerno, kaj ĝiaj guanidingrupoj cikle moviĝas. inter helicoj 1′ kaj 1 per interagoj inter la spino Thr32 kaj flanka ĉeno (Fig. S5a,b).Tyr34 etendiĝas en la kavaĵon forlasante du malgrandajn kavaĵojn tra kiuj Arg37 povas interagi kun la solvilo.
Ig-similaj β-sandviĉaj domajnoj estas granda superfamilio de proteinoj kiuj dividas la komunan trajton de du aŭ pli da plur-senhelpaj amfipatiaj β-tukoj interagaj per hidrofoba kerno 39. La C-fina Ig-simila domajno de SPACA6 havas la saman padronon. kaj konsistas el du tavoloj (Fig. S6a).Folio 1 estas β-folio de kvar fadenoj (fadenoj D, F, H, kaj I) kie fadenoj F, H, kaj I formas kontraŭ-paralelan aranĝon, kaj fadenoj I kaj D prenas paralelan interagon.Tablo 2 estas malgranda kontraŭ-paralela duoble-fadena beta-folio (fadenoj E kaj G).Interna disulfida ligo estis observita inter la C-finaĵo de la E-ĉeno kaj la centro de la H-ĉeno (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Tiu disulfidobligacio estas analoga al la disulfidobligacio en la β-sandviĉa domajno de imunglobulino40,41.
La kvar-fadena β-tuko tordas laŭ sia tuta longo, formante nesimetriajn randojn kiuj malsamas laŭ formo kaj elektrostatiko.La pli maldika rando estas plata hidrofoba media surfaco, kiu elstaras kompare kun la ceteraj neegalaj kaj elektrostatike diversaj surfacoj en SPACA6 (Fig. S6b, c).Aŭreolo de senŝirmaj spinaj karbonil/aminogrupoj kaj polusaj flankaj ĉenoj ĉirkaŭas la hidrofoban surfacon (Fig. S6c).La pli larĝa marĝeno estas kovrita per kovrita helikforma segmento kiu blokas la N-finan parton de la hidrofoba kerno kaj formas tri hidrogenajn ligojn kun la malferma polusa grupo de la F-ĉena spino (Fig. S6d).La C-fina parto de tiu rando formas grandan poŝon kun parte senŝirma hidrofoba kerno.La poŝo estas ĉirkaŭita de pozitivaj ŝargoj pro tri aroj de duoblaj argininrestaĵoj (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 kaj Arg212-Arg214) kaj centra histidino (His220) (Figuro S6e).
La ĉarnirregiono estas mallonga segmento inter la helikforma domajno kaj la Ig-simila domajno, konsistante el unu kontraŭparalela tri-fadena β-tavolo (fadenoj A, B kaj C), malgranda 310 helico, kaj pluraj longaj hazardaj helikformaj segmentoj.(Fig. S7).Reto de kovalentaj kaj elektrostatikaj kontaktoj en la ĉarnirregiono ŝajnas stabiligi la orientiĝon inter 4HB kaj la Ig-simila domajno.La reto povas esti dividita en tri partojn.La unua parto inkludas du CXXC-ĉeftemojn (27CXXC30 kaj 139CXXC142) kiuj formas paron de disulfidobligacioj inter la β-harpinglo en la ĉarniro kaj la 1′ helico en 4HB.La dua parto inkludas elektrostatikajn interagojn inter la Ig-simila domajno kaj la ĉarniro.Glu132 en la ĉarniro formas salponton kun Arg233 en la Ig-simila domajno kaj Arg135 en la ĉarniro.La tria parto inkludas kovalentan ligon inter la Ig-simila domajno kaj la ĉarnirregiono.Du disulfidobligacioj (Cys124-Cys147 kaj Cys128-Cys153) ligas la ĉarnirobuklon al ligilo kiu estas stabiligita per elektrostatikaj interagoj inter Gln131 kaj la spina funkcia grupo, permesante aliron al la unua Ig-simila domajno.ĉeno.
La strukturo de la ektodomajno PACA6 kaj individuaj strukturoj de 4HB kaj Ig-similaj domajnoj estis uzataj por serĉi strukture similajn rekordojn en proteinaj datumbazoj 42 .Ni identigis matĉojn kun altaj Dali Z-poentoj, malgrandaj normaj devioj kaj grandaj LALI-poentoj (ĉi-lasta estante la nombro da strukture ekvivalentaj restaĵoj).Dum la unuaj 10 sukcesoj de la plena ektodomajna serĉo (Tablo S1) havis akcepteblan Z-poentaron de >842, serĉo por 4HB aŭ Ig-simila domajno sole montris ke la plej multaj el tiuj sukcesoj egalrilatis al β-sandviĉoj nur.ĉiea faldo trovita en multaj proteinoj.Ĉiuj tri serĉoj en Dali donis nur unu rezulton: IZUMO1.
Oni longe sugestis, ke SPACA6 kaj IZUMO1 kunhavas strukturajn similecojn7,32,37.Kvankam la ektodomajnoj de tiuj du gamet-fuzio-rilataj proteinoj dividas nur 21%-sekvencidentecon (Figuro S8a), kompleksa indico, inkluzive de konservita disulfidobligaciopadrono kaj antaŭdirita C-fina Ig-simila domajno en SPACA6, permesis fruajn provojn konstrui homologiomodelo de A muso SPACA6 uzanta IZUMO1 kiel ŝablonon37.Nia strukturo konfirmas ĉi tiujn antaŭdirojn kaj montras la veran gradon de simileco.Fakte, la SPACA6 kaj IZUMO137,43,44-strukturoj dividas la saman du-domajnan arkitekturon (Fig. S8b) kun similaj 4HB kaj Ig-similaj β-sandviĉaj domajnoj ligitaj per ĉarnirregiono (Fig. S8c).
IZUMO1 kaj PACA6 4HB havas oftajn diferencojn de konvenciaj spiralaj pakaĵoj.Tipaj 4HBs, kiel tiuj trovitaj en SNARE-proteinkompleksoj implikitaj en endosoma fuzio 45,46, havas egale spacigitajn helicojn konservantajn konstantan kurbiĝon ĉirkaŭ centra akso 47. En kontrasto, la helikformaj domajnoj en kaj IZUMO1 kaj SPACA6 estis distorditaj, kun varia kurbeco kaj malebena pakado (Figuro S8d).La tordaĵo, verŝajne kaŭzita de la triangulo formita de helicoj 1′, 1 kaj 2, estas retenita en IZUMO1 kaj SPACA6 kaj stabiligita per la sama CXXC-ĉeftemo sur helico 1′.Tamen, la kroma disulfidobligacio trovita en SPACA6 (Cys41 kaj Cys55 kovalente ligante helicojn 1 kaj 2 supre) kreas pli akran apekson ĉe la triangulapekso, igante SPACA6 pli tordita ol IZUMO1, kun pli okulfrapaj kavtrianguloj.Krome, al IZUMO1 mankas Arg37 observita en la centro de ĉi tiu kavaĵo en SPACA6.En kontrasto, IZUMO1 havas pli tipan hidrofoban kernon de alifataj kaj aromaj restaĵoj.
IZUMO1 havas Ig-similan domajnon konsistantan el duoble-senhelpa kaj kvin-fadena β-folio43.La ekstra fadeno en IZUMO1 anstataŭigas la volvaĵon en SPACA6, kiu interagas kun la F-fadeno por limigi spinajn hidrogenajn ligojn en la fadeno.Interesa punkto de komparo estas la antaŭdirita surfacŝargo de la Ig-similaj domajnoj de la du proteinoj.La IZUMO1-surfaco estas pli negative ŝargita ol la SPACA6-surfaco.Kroma pagendaĵo situas proksime de la C-finaĵo alfrontanta la spermmembranon.En SPACA6, la samaj regionoj estis pli neŭtralaj aŭ pozitive ŝargitaj (Fig. S8e).Ekzemple, la hidrofoba surfaco (pli maldikaj randoj) kaj pozitive ŝargitaj fosaĵoj (pli larĝaj randoj) en SPACA6 estas negative ŝargitaj en IZUMO1.
Kvankam la rilato kaj malĉefaj strukturelementoj inter IZUMO1 kaj SPACA6 estas bone konservitaj, la struktura vicigo de la Ig-similaj domajnoj montris, ke la du domajnoj malsamas en sia ĝenerala orientiĝo rilate unu al la alia (Fig. S9).La spiralfasko de IZUMO1 estas kurba ĉirkaŭ la β-sandviĉo, kreante la antaŭe priskribitan "bumerango-" formon je proksimume 50° de la centra akso.En kontrasto, la helikforma trabo en SPACA6 estis klinita proksimume 10° en la kontraŭa direkto.La diferencoj en tiuj orientiĝoj estas verŝajne pro diferencoj en la ĉarnirregiono.Sur la primara sekvencnivelo, IZUMO1 kaj SPACA6 dividas nur malmulte da sekvencsimileco ĉe la ĉarniro, kun la escepto de cisteino, glicino, kaj asparta acidrestaĵoj.Kiel rezulto, hidrogenaj ligoj kaj elektrostatikaj retoj estas tute malsamaj.β-tukoj sekundaraj strukturelementoj estas dividitaj fare de IZUMO1 kaj SPACA6, kvankam la katenoj en IZUMO1 estas multe pli longaj kaj la 310 helico (helico 5) estas unika al SPACA6.Tiuj diferencoj rezultigas malsamajn domajnorientiĝojn por du alie similaj proteinoj.
Nia serĉo pri servilo de Dali malkaŝis, ke SPACA6 kaj IZUMO1 estas la nuraj du eksperimente determinitaj strukturoj stokitaj en la proteindatumbazo, kiuj havas ĉi tiun apartan 4HB-faldon (Tablo S1).Pli lastatempe, DeepMind (Alfabeto/Google) evoluigis AlphaFold, sistemon bazitan sur neŭrala reto, kiu povas precize antaŭdiri la 3D-strukturojn de proteinoj de primaraj sekvencoj48.Baldaŭ post kiam ni solvis la SPACA6-strukturon, la datumbazo AlphaFold estis publikigita, provizante prognozajn strukturmodelojn kovrantajn 98.5% de ĉiuj proteinoj en la homa proteomo48,49.Uzante nian solvitan SPACA6-strukturon kiel serĉmodelon, struktura homologioserĉo por la modelo en la AlphaFold homa proteomo identigis kandidatojn kun eblaj strukturaj similecoj al SPACA6 kaj IZUMO1.Konsiderante la nekredeblan precizecon de AlphaFold en antaŭdiro de SPACA6 (Fig. S10a) - precipe la 1.1 Å rms-ektodomajno kompare kun nia solvita strukturo (Fig. S10b) - ni povas esti certaj, ke la identigitaj SPACA6-matĉoj verŝajne estos precizaj.
Antaŭe, PSI-BLAST serĉis la IZUMO1-areton kun tri aliaj sperm-rilataj proteinoj: IZUMO2, IZUMO3 kaj IZUMO450.AlphaFold antaŭdiris ke tiuj IZUMO-familioproteinoj faldas en la 4HB-domajnon kun la sama disulfidobligaĵpadrono kiel IZUMO1 (Figures 3a kaj S11), kvankam al ili mankas Ig-simila domajno.Estas hipotezite ke IZUMO2 kaj IZUMO3 estas unuflankaj membranproteinoj similaj al IZUMO1, dum IZUMO4 ŝajnas esti kaŝita.La funkcioj de IZUMO 2, 3, kaj 4 proteinoj en gametfuzio ne estis determinitaj.IZUMO3 povas ludi rolon en akrozoma biogenezo dum spermevoluo51 kaj la IZUMO-proteino estas trovita formi komplekson50.La konservado de IZUMO-proteinoj en mamuloj, reptilioj, kaj amfibioj indikas ke ilia ebla funkcio estas kongrua kun tiu de aliaj konataj gamet-fuzio-rilataj proteinoj, kiel ekzemple DCST1/2, SOF1, kaj FIMP.
Diagramo de la domajna arkitekturo de la IST-superfamilio, kun 4HB, ĉarniro, kaj Ig-similaj domajnoj elstarigitaj en oranĝa, verda, kaj blua, respektive.IZUMO4 havas unikan C-finan regionon kiu aspektas nigra.Konfirmitaj kaj supozaj disulfidaj ligoj estas montritaj per solidaj kaj punktlinioj, respektive.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), kaj AlphaTMEM95 DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) estas montritaj en la sama kolorgamo kiel panelo A. Disulfidobligacioj estas montritaj en magento.TMEM95, IZUMO2 kaj IZUMO3 transmembranhelicoj ne estas montritaj.
Male al la IZUMO-proteino, aliaj SPACA-proteinoj (t.e., SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 kaj SPACA9) supozeble estas strukture malsamaj de SPACA6 (Fig. S12).Nur SPACA9 havas 4HB, sed ĝi ne estas atendita havi la saman paralel-kontraŭ-paralelan orientiĝon aŭ la saman disulfidobligacion kiel SPACA6.Nur SPACA1 havas similan Ig-similan domajnon.AlphaFold antaŭdiras, ke SPACA3, SPACA4 kaj SPACA5 havas tute malsaman strukturon ol SPACA6.Interese, SPACA4 ankaŭ povas ludi rolon en fekundigo, sed laŭ pli granda mezuro ol SPACA6, anstataŭe faciligante la interagadon inter spermo kaj ocita zono pellucida52.
Nia AlphaFold-serĉo trovis alian kongruon por IZUMO1 kaj PACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, ununura sperm-specifa transmembranproteino, igas masklajn musojn malfekundaj kiam forigita 32,33.Spermatozooj al kiuj mankas TMEM95 havis normalan morfologion, motilecon, kaj la kapablon penetri la zonan pellucidan kaj ligi al la ovomembrano, sed ne povis kunfandiĝi kun la ocitmembrano.Antaŭaj studoj montris, ke TMEM95 dividas strukturajn similecojn kun IZUMO133.Efektive, la modelo AlphaFold konfirmis, ke TMEM95 estas 4HB kun la sama paro de CXXC-ĉeftemoj kiel IZUMO1 kaj SPACA6 kaj la sama kroma disulfidligo inter helicoj 1 kaj 2 trovita en SPACA6 (Fig. 3a kaj S11).Kvankam al TMEM95 mankas Ig-simila domajno, ĝi havas regionon kun disulfidobliga ŝablono simila al la SPACA6 kaj IZUMO1 ĉarnirregionoj (Fig. 3b).Je la publikigo de ĉi tiu manuskripto, la preprinta servilo raportis la strukturon de TMEM95, konfirmante la rezulton de AlphaFold53.TMEM95 estas tre simila al SPACA6 kaj IZUMO1 kaj estas evolue konservita jam en amfibioj (Fig. 4 kaj S13).
La PSI-BLAST-serĉo uzis la NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, kaj SOF1-datumbazon por determini la pozicion de tiuj sekvencoj en la arbo de vivo.Distancoj inter branĉpunktoj ne estas montritaj al skalo.
La okulfrapa totala struktura simileco inter SPACA6 kaj IZUMO1 indikas ke ili estas fondmembroj de konservita struktura superfamilio kiu inkludas la TMEM95 kaj IZUMO 2, 3, kaj 4 proteinojn.konataj membroj: IZUMO1, SPACA6 kaj TMEM95.Ĉar nur kelkaj membroj posedas Ig-similajn domajnojn, la markostampo de la IST-superfamilio estas la 4HB-domajno, kiu havas unikajn trajtojn komunajn al ĉiuj ĉi tiuj proteinoj: 1) Volvita 4HB kun helicoj aranĝitaj en kontraŭ-paralela/paralela alterno (Figo). . 5a), 2) la pakaĵo havas triangulan vizaĝon konsistantan el du helicoj ene de la pakaĵo kaj tria vertikala helico (Fig. ŝlosila areo (Fig. 5c). La CXXC-ĉeftemo, trovita en tioredoksin-similaj proteinoj, povas funkcii. kiel redox-sensilo 54,55,56 , dum la ĉeftemo en IST-familianoj povas esti asociita kun proteindisulfidizomerazoj kiel ekzemple ERp57 en gametfandado.Roloj estas asociitaj 57,58.
Membroj de la IST-superfamilio estas difinitaj per tri karakterizaĵoj de la 4HB-domajno: kvar helicoj alternantaj inter paralela kaj kontraŭparalela orientiĝo, ba-triangulaj helikformaj faskoj, kaj ca CXXC duobla ĉeftemo formita inter malgrandaj molekuloj.) N-finaj helicoj (oranĝaj) kaj ĉarnira regiono β-harpinglo (verda).
Surbaze de la simileco inter SPACA6 kaj IZUMO1, la kapablo de la unua ligi al IZUMO1 aŭ JUNO estis testita.Biotavola interferometrio (BLI) estas kinet-bazita liga metodo kiu antaŭe estis uzita por kvantigi la interagadon inter IZUMO1 kaj JUNO.Post kovado de la biotin-etikedita sensilo kun IZUMO1 kiel logaĵo kun alta koncentriĝo de JUNO-analito, forta signalo estis detektita (Fig. S14a), indikante lig-induktitan ŝanĝon en la dikeco de la biomaterialo alkroĉita al la sensila pinto.Similaj signaloj (te, JUNO kunligita al la sensilo kiel logilo kontraŭ IZUMO1-analito) (Fig. S14b).Neniu signalo estis detektita kiam SPACA6 estis uzata kiel analizilo kontraŭ sensil-ligita IZUMO1 aŭ sensil-ligita JUNO (Figuro S14a,b).La foresto de tiu signalo indikas ke la eksterĉela domajno de SPACA6 ne interagas kun la eksterĉela domajno de IZUMO1 aŭ JUNO.
Ĉar la BLI-analizo estas bazita sur biotiniligo de liberaj lizinrestaĵoj sur la logilproteino, tiu modifo povas malhelpi ligadon se lizinrestaĵoj estas implikitaj en la interagado.Krome, la orientiĝo de la ligado rilate al la sensilo povas krei sterajn malhelpojn, tiel ke konvenciaj tirmalsuprenaj analizoj ankaŭ estis faritaj sur la rekombinaj SPACA6, IZUMO1 kaj JUNO-ektodomajnoj.Malgraŭ tio, SPACA6 ne precipitiĝis kun His-etikedita IZUMO1 aŭ His-etikedita JUNO (Fig. S14c, d), indikante neniun interagadon kongrua kun tio observita en BLI-eksperimentoj.Kiel pozitiva kontrolo, ni konfirmis la interagon de JUNO kun etikedita His IZUMO1 (Figuroj S14e kaj S15).
Malgraŭ la struktura simileco inter SPACA6 kaj IZUMO1, la malkapablo de SPACA6 ligi JUNO'n ne estas surpriza.La surfaco de homa IZUMO1 havas pli ol 20 restaĵojn kiuj interagas kun JUNO, inkluzive de restaĵoj de ĉiu el la tri regionoj (kvankam la plej multaj el ili situas en la ĉarnirregiono) (Fig. S14f).De tiuj restaĵoj, nur unu estas konservita en PACA6 (Glu70).Dum multaj restaĵanstataŭaĵoj retenis siajn originajn biokemiajn trajtojn, la esenca Arg160-restaĵo en IZUMO1 estis anstataŭigita per la negative ŝargita Asp148 en SPACA6;antaŭaj studoj montris, ke la mutacio Arg160Glu en IZUMO1 preskaŭ tute nuligas ligon al JUNO43.Krome, la diferenco en domajna orientiĝo inter IZUMO1 kaj SPACA6 signife pliigis la surfacareon de la JUNO-liga loko de la ekvivalenta regiono sur SPACA6 (Fig. S14g).
Malgraŭ la konata bezono de SPACA6 por gametfuzio kaj ĝia simileco al IZUMO1, SPACA6 ne ŝajnas havi ekvivalentan JUNO-ligan funkcion.Tial ni klopodis kombini niajn strukturajn datumojn kun signoj de graveco provizitaj de evolua biologio.Sekvencparaleligo de PACA6-homologoj montras la konservadon de la komuna strukturo preter mamuloj.Ekzemple, cisteinaj restaĵoj ĉeestas eĉ en malproksime rilataj amfibioj (Fig. 6a).Uzante la ConSurf-servilon, multoblaj sekvencparalelicaj retendatenoj de 66 sekvencoj estis mapitaj al la SPACA6-surfaco.Tiu speco de analizo povas montri kiuj restaĵoj estis konservitaj dum proteinevoluo kaj povas indiki kiuj surfacregionoj ludas rolon en funkcio.
Sekvencparaleligo de PACA6-ektodomajnoj de 12 malsamaj specioj preparitaj uzante CLUSTAL OMEGA.Laŭ la analizo de ConSurf, la plej konservativaj pozicioj estas markitaj en bluo.Cisteinaj restaĵoj estas reliefigitaj ruĝe.Domajnaj limoj kaj sekundaraj strukturelementoj estas montritaj ĉe la pinto de la paraleligo, kie sagoj indikas β-fadenojn kaj ondoj indikas helicojn.La NCBI-Aliridentigiloj enhavantaj la sekvencojn estas: homo (Homo sapiens, NP_001303901), mandrilo (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucina simio (Cebus-imita, XP_017359366), ĉevalo (Equus caballus), killer (XP6102350, XP_01023) XP_032_034) .), ŝafo (Ovis aries, XP_014955560), elefanto (Loxodonta africana, XP_010585293), hundo (Canis lupus familyis, XP_025277208), muso (Mus musculus, NP_001156381), tasmania diablo (Sar61, XP_03, XP_03, XP_03), 8) , 61_89 kaj Bovrano (Bufo bufo, XP_040282113).La numerado baziĝas sur homa ordo.b Surfaca reprezentado de la SPACA6 strukturo kun 4HB ĉe la pinto kaj Ig-simila domajno ĉe la fundo, koloroj bazitaj sur konservadtaksoj de la ConSurf-servilo.La plej bone konservitaj partoj estas en bluo, la modere konservitaj partoj estas en blanka, kaj la malplej konservitaj estas en flava.purpura cisteino.Tri surfacaj pecetoj montrantaj altan nivelon de protekto estas montritaj en la enmetitaj etikeditaj pecetoj 1, 2 kaj 3. 4HB-bildstrio estas montrita en la enmetita supre dekstre (sama kolorskemo).
La SPACA6-strukturo havas tri tre konservitajn surfacregionojn (Fig. 6b).Peceto 1 ampleksas 4HB kaj la ĉarnirregionon kaj enhavas du konservitajn CXXC-disulfidajn pontojn, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 ĉarnireton (Fig. S7), kaj tri konservitajn eksterajn aromajn restaĵojn (Phe31, Tyr73, Phe137).pli larĝa rando de la Ig-simila domajno (Fig. S6e), kiu reprezentas plurajn pozitive ŝargitajn restaĵojn sur la spermsurfaco.Kurioze, ĉi tiu peceto enhavas antikorpan epitopon, kiu antaŭe pruviĝis malhelpi la funkcion de PACA6 30.Regiono 3 enhavas la ĉarniron kaj unu flankon de la Ig-simila domajno;tiu regiono enhavas konservitajn prolinojn (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) kaj eksteren-fruntaalajn polusajn/ŝarĝitajn restaĵojn.Surprize, la plej multaj el la restaĵoj sur la surfaco de 4HB estas tre variaj (Fig. 6b), kvankam la faldo estas konservita ĉie en la SPACA6-homologo (kiel indikite per la konservativismo de la hidrofoba pakkerno) kaj preter la IST-superfamilio.
Kvankam tio estas la plej malgranda regiono en SPACA6 kun la plej malmultaj konstateblaj sekundaraj strukturelementoj, multaj ĉarnirregionrestoj (inkluzive de regiono 3) estas tre konservitaj inter SPACA6-homologoj, kiuj povas indiki ke la orientiĝo de la helikforma fasko kaj β-sandviĉo ludas rolon.kiel konservativulo.Tamen, malgraŭ ampleksa hidrogena ligo kaj elektrostatikaj retoj en la ĉarnirregiono de SPACA6 kaj IZUMO1, signoj de interna fleksebleco povas esti viditaj en la paraleligo de la multoblaj permesitaj strukturoj de IZUMO137,43,44.La vicigo de la individuaj domajnoj bone interkovris, sed la orientiĝo de la domajnoj rilate unu al la alia variis de 50° ĝis 70° de la centra akso (Fig. S16).Por kompreni la konformigan dinamikon de PACA6 en solvo, SAXS-eksperimentoj estis faritaj (Fig. S17a,b).Ab initio rekonstruo de la SPACA6-ektodomajno konformis al bastonkristalstrukturo (Fig. S18), kvankam la Kratky-intrigo montris iom da grado da fleksebleco (Fig. S17b).Tiu formo kontrastas al IZUMO1, en kiu la nebindita proteino alprenas bumerangan formon kaj en la krado kaj en solvaĵo43.
Por specife identigi la flekseblan regionon, hidrogen-deŭterio-interŝanĝa mas-spektroskopio (H-DXMS) estis farita sur SPACA6 kaj komparita kun datumoj antaŭe akiritaj sur IZUMO143 (Fig. 7a,b).SPACA6 estas klare pli fleksebla ol IZUMO1, kiel konstatite per la pli alta deŭterio-interŝanĝo ĉie en la strukturo post 100,000 s da interŝanĝo.En ambaŭ strukturoj, la C-fina parto de la ĉarnirregiono montras altnivelan de interŝanĝo, kiu verŝajne permesas limigitan rotacion de 4HB kaj Ig-similaj domajnoj relative unu al la alia.Interese, la C-fina parto de la SPACA6 ĉarniro, konsistanta el la 147CDLPLDCP154-restaĵo, estas tre konservita regiono 3 (Fig. 6b), eble indikante ke interdomajna fleksebleco estas evolue konservita trajto de SPACA6.Laŭ la analizo de fleksebleco, KD-termofandaj datumoj montris, ke SPACA6 (Tm = 51,2 °C) estas malpli stabila ol IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Fig. S1e kaj S19).
a H-DXMS bildoj de SPACA6 kaj b IZUMO1.La procenta interŝanĝo de deŭterio estis determinita ĉe la indikitaj tempopunktoj.Niveloj de hidrogen-deŭterio interŝanĝo estas indikitaj per koloro sur gradientskalo de blua (10%) ĝis ruĝa (90%).Nigraj skatoloj reprezentas areojn de alta interŝanĝo.La limoj de 4HB, ĉarniro kaj Ig-simila domajno observitaj en la kristalstrukturo estas montritaj super la primara sekvenco.Deŭterio-interŝanĝniveloj je 10 s, 1000 s, kaj 100,000 s estis intrigitaj sur striodiagramo supermetita sur la travideblaj molekulaj surfacoj de SPACA6 kaj IZUMO1.Partoj de strukturoj kun deŭteria interŝanĝnivelo sub 50% estas koloraj blankaj.Areoj super 50% H-DXMS-interŝanĝo estas koloraj en gradientskalo.
La uzo de CRISPR/Cas9 kaj musgenaj knokaŭtaj genetikaj strategioj kondukis al la identigo de pluraj faktoroj gravaj por spermo kaj ovo-ligado kaj fuzio.Krom la bone karakterizita interago de IZUMO1-JUNO kaj CD9-strukturo, la plej multaj el la proteinoj asociitaj kun gametfuzio restas strukture kaj funkcie enigma.La biofizika kaj struktura karakterizado de SPACA6 estas alia peco de la adhero/fuzia molekula enigmo dum fekundigo.
SPACA6 kaj aliaj membroj de la IST-superfamilio ŝajnas esti tre konservitaj en mamuloj same kiel individuaj birdoj, reptilioj kaj amfibioj;fakte, supozeble ke SPACA6 eĉ estas postulata por fekundigo en zebrofiŝo 59. Tiu distribuo estas simila al aliaj konataj gametfuzio-rilataj proteinoj kiel ekzemple DCST134, DCST234, FIMP31, kaj SOF132, sugestante ke tiuj faktoroj estas HAP2-mankaj (ankaŭ konataj kiel GCS1) proteinoj kiuj respondecas pri la kataliza agado de multaj protistoj., plantoj kaj artropodoj.Fekundigitaj fuzioproteinoj 60, 61. Malgraŭ la forta struktura simileco inter SPACA6 kaj IZUMO1, knokaŭto de genoj kodantaj ambaŭ el tiuj proteinoj rezultigis malfekundecon en masklaj musoj, indikante ke iliaj funkcioj en gametfuzio ne estas duobligitaj..Pli larĝe, neniu el la konataj spermproteinoj necesaj por la adherfazo de fuzio estas redunda.
Ĝi restas malferma demando ĉu SPACA6 (kaj aliaj membroj de la IST-superfamilio) partoprenas en intergametikaj krucvojoj, formas intragametajn retojn por rekruti gravajn proteinojn al fuziopunktoj, aŭ eble eĉ funkcias kiel evitemaj fuzogenoj.Kunimunoprecipitaj studoj en HEK293T-ĉeloj rivelis interagon inter plenlonga IZUMO1 kaj SPACA632.Tamen, niaj rekombinaj ektodomajnoj ne interagis en vitro, sugestante ke la interagoj viditaj en Noda et al.estis ambaŭ forigitaj en la konstruo (notu la citoplasman voston de IZUMO1, kiu pruviĝis nenecesa por fekundigo62).Alternative, IZUMO1 kaj/aŭ SPACA6 povas postuli specifajn ligajn mediojn, kiujn ni ne reproduktas en vitro, kiel fiziologie specifaj formoj aŭ molekulaj kompleksoj enhavantaj aliajn proteinojn (konatajn aŭ ankoraŭ ne malkovritajn).Kvankam la IZUMO1-ektodomajno verŝajne mediacias alligiĝon de spermatozooj al la ovo en la perivitelina spaco, la celo de la SPACA6-ektodomajno estas neklara.
La strukturo de SPACA6 rivelas plurajn konservitajn surfacojn kiuj povas esti implikitaj en protein-proteinaj interagoj.La konservita parto de la ĉarnirregiono tuj najbara al la CXXC-ĉeftemo (nomumita Peceto 1 supre) havas plurajn eksteren-fruntaalajn aromajn restaĵojn kiuj ofte estas rilataj al hidrofobaj kaj π-stakaj interagoj inter biomolekuloj.La larĝaj flankoj de la Ig-simila domajno (regiono 2) formas pozitive ŝargitan sulkon kun tre konservitaj Arg kaj His-restaĵoj, kaj antikorpoj kontraŭ tiu regiono antaŭe estis uzitaj por bloki gametfuzion 30 .La antikorpo rekonas la linearan epitopon 212RIRPAQLTHRGTFS225, kiu havas tri el la ses argininrestaĵoj kaj tre konservitan His220.Ne estas klare ĉu la misfunkcio ŝuldiĝas al blokado de ĉi tiuj specifaj restaĵoj aŭ al la tuta regiono.La loko de tiu interspaco proksime de la C-finstacio de la β-sandviĉo indikas cis-interagojn kun najbaraj spermproteinoj, sed ne kun ocitproteinoj.Krome, la reteno de tre fleksebla prolin-riĉa implikaĵo (ejo 3) ene de la ĉarniro povas esti la loko de protein-proteina interagado aŭ, pli verŝajne, indikas la retenon de fleksebleco inter la du domajnoj.Sekso estas grava por la nekonata rolo de SPACA6.fuzio de gametoj.
SPACA6 havas trajtojn de interĉelaj adherproteinoj, inkluzive de Ig-similaj β-sandviĉoj.Multaj gluaj proteinoj (ekz., kadherinoj, integrinoj, adhesinoj, kaj IZUMO1) posedas unu aŭ plurajn β-sandviĉajn domajnojn kiuj etendas proteinojn de la ĉelmembrano ĝis siaj mediaj celoj63,64,65.La Ig-simila domajno de SPACA6 ankaŭ enhavas ĉeftemon ofte trovitan en β-sandviĉoj de adhero kaj kohezio: duobloj de paralelaj fadenoj ĉe la finoj de β-sandviĉoj, konataj kiel mekanikaj krampoj66.Estas kredite ke tiu ĉeftemo pliigas reziston al tondfortoj, kio estas valora por proteinoj implikitaj en interĉelaj interagoj.Tamen, malgraŭ tiu simileco al adhesinoj, ekzistas nuntempe neniu indico ke PACA6 interagas kun ovoblankoj.La SPACA6-ektodomajno ne kapablas ligi al JUNO, kaj SPACA6-esprimaj HEK293T-ĉeloj, kiel montrite ĉi tie, apenaŭ interagas kun ocitoj malhavantaj zonon 32.Se PACA6 establas intergametikajn ligojn, tiuj interagoj povas postuli post-tradukajn modifojn aŭ esti stabiligitaj per aliaj spermproteinoj.En subteno de ĉi-lasta hipotezo, IZUMO1-mankaj spermatozooj ligas al ocitoj, montrante ke molekuloj krom IZUMO1 estas implikitaj en la gameta adherpaŝo 27 .
Multaj virusaj, ĉelaj, kaj evoluaj fuzioproteinoj havas trajtojn kiuj antaŭdiras sian funkcion kiel fuzogenoj.Ekzemple, virusfuzioglikoproteinoj (klasoj I, II kaj III) havas hidrofoban fuziopeptidon aŭ buklon ĉe la fino de la proteino kiu estas enigita en la mastro-membranon.La hidrofilecmapo de IZUMO143 kaj la strukturo (determinita kaj antaŭdirita) de la IST-superfamilio montris neniun ŝajnan hidrofoban fuziopeptidon.Tiel, se iuj proteinoj en la IST-superfamilio funkcias kiel fuzogenoj, ili faras tion en maniero diferenca de aliaj konataj ekzemploj.
En konkludo, la funkcioj de la membroj de la IST-superfamilio de proteinoj asociitaj kun gametfuzio restas tenta mistero.Nia karakterizita SPACA6 rekombina molekulo kaj ĝia solvita strukturo provizos sciojn pri la rilatoj inter ĉi tiuj komunaj strukturoj kaj ilia rolo en gameta alligiteco kaj fuzio.
La DNA-sekvenco egalrilatanta al la antaŭdirita homa SPACA6-ektodomajno (NCBI-surtroniĝnumero NP_001303901.1; restaĵoj 27-246) estis kodon-optimumigita por esprimo en Drosophila melanogaster S2-ĉeloj kaj sintezita kiel genfragmento kun la sekvenco kodanta Kozak (Eurofins)., la BiP-sekrecia signalo kaj la ekvivalentaj 5′ kaj 3′ finaĵoj por lig-sendependa klonado de tiu geno en pMT-esprimvektoron bazitan sur metalotioneinreklamanto modifita por selektado kun puromicin (pMT-puro).La pMT-puro-vektoro ĉifras trombinan fendlokon sekvitan per 10x-Lia C-fina etikedo (Figuro S2).
Stabila transfekto de la SPACA6 pMT-puro-vektoro en D. melanogaster S2 (Gibco) ĉelojn estis farita simile al la protokolo uzita por IZUMO1 kaj JUNO43.S2-ĉeloj estis degelitaj kaj kreskigitaj en la medio de Schneider (Gibco) kompletigita kun fina koncentriĝo de 10% (v/v) varmege senaktivigita feta bovida serumo (Gibco) kaj 1X antimikota antibiotiko (Gibco).Fruaj trairejoj ĉeloj (3.0 x 106 ĉeloj) estis tegitaj en individuaj putoj de 6-putaj platoj (Corning).Post 24 horoj da kovado je 27 °C, ĉeloj estis transfektitaj kun miksaĵo de 2 mg de la PACA6 pMT-puro-vektoro kaj Effectene-transfekta reakciilo (Qiagen) laŭ la protokolo de la fabrikanto.Transfektitaj ĉeloj estis kovataj dum 72 horoj kaj poste rikoltitaj kun 6 mg/ml puromicino.Ĉeloj tiam estis izolitaj de kompleta Schneider-medio kaj metitaj en seruma libera Insect-XPRESS medio (Lonza) por grandskala proteinproduktado.1 L aro de S2-ĉelkulturo estis kreskigita al 8-10 × 106 ml-1 ĉeloj en 2 L ventolita platfunda polipropilena Erlenmeyer-flakono kaj poste steriligita kun fina koncentriĝo de 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) kaj sterila filtrita.induktita.La induktitaj kulturoj estis kovataj je 27° C je 120 rpm dum kvar tagoj.
Kondiĉita medio enhavanta SPACA6 estis izolita per centrifugado je 5660 × g je 4 °C sekvita de Centramate tanĝanta flua filtra sistemo (Pall Corp) kun 10 kDa MWCO-membrano.Apliki koncentritan medion enhavantan SPACA6 al kolumno de 2 ml Ni-NTA agarose rezino (Qiagen).La Ni-NTA-rezino estis lavita kun 10 kolumno-volumoj (CV) de bufro A kaj tiam 1 CV de bufro A estis aldonita por doni finan imidazolkoncentriĝon de 50 mM.SPACA6 estis eluita kun 10 ml da bufro A suplementita per imidazole al fina koncentriĝo de 500 mM.Restrikta klaso trombino (Millipore Sigma) estis aldonita rekte al la dializotubo (MWCO 12-14 kDa) je 1 unuo per mg SPACA6 kontraŭ 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 kaj 150 mM NaCl (buffer B) por dializo.) je 4 °C dum 48 horoj.La trombin-fendita SPACA6 tiam estis diluita trioble por redukti salkoncentriĝon kaj ŝarĝita sur 1 ml MonoS 5/50 GL katjoninterŝanĝkolumno (Cytiva/GE) ekvilibrigita kun 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.La katjoninterŝanĝilo estis lavita per 3 CV de 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, tiam SPACA6 estis eluita kun lineara gradiento de 0 ĝis 500 mM NaCl en 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 por 25 CV.Post interŝanĝa kromatografio, SPACA6 estis koncentrita al 1 ml kaj eluita izokrate de ENrich SEC650 10 x 300 kolumno (BioRad) ekvilibrigita kun bufro B. Laŭ la kromatogramo, naĝejo kaj koncentraj frakcioj enhavantaj SPACA6.Pureco estis kontrolita per Coomassie-makula elektroforezo sur 16% SDS-poliakrilamida ĝelo.Proteinkoncentriĝo estis kvantigita per absorbo je 280 nm uzante la Beer-Lambert-leĝon kaj la teorian molan formortkoeficienton.
Purigita SPACA6 estis dializata dum la nokto kontraŭ 10 mM natria fosfato, pH 7.4 kaj 150 mM NaF kaj diluita al 0.16 mg/mL antaŭ analizo per KD-spektroskopio.Spektra skanado de KD-oj kun ondolongo de 185 ĝis 260 nm estis kolektita sur spektropolarimetro Jasco J-1500 uzante kvarcokuvetojn kun 1 mm optika padlongo (Helma) je 25 °C kun rapideco de 50 nm/min.La KD-spektroj estis bazlinio korektitaj, averaĝis pli ol 10 akirojn, kaj konvertitaj al meza resta elipseco (θMRE) en gradoj cm2/dmol:
kie Mw estas la molekula pezo de ĉiu provaĵo en Da;N estas la nombro da aminoacidoj;θ estas la elipseco en miligradoj;d respondas al la longo de la optika vojo en cm;proteina koncentriĝo en unuoj.