310 10*1mm Neoksidebla ŝtalo volvita tubo kemia komponanto, La N-finaj domajnoj de spidroino formas hidroĝelojn bazitajn sur amiloidaj fibriloj kaj provizas platformon por senmovigo de proteinoj.

Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Glitiloj montrante tri artikolojn per diapozitivo.Uzu la malantaŭan kaj sekvan butonojn por moviĝi tra la lumbildoj, aŭ la butonojn de glit-regiloj ĉe la fino por moviĝi tra ĉiu lumbildo.

Specifo

310 10 * 1mm Neoksidebla ŝtalo bobenita tubo provizantoj

Kemia Komponado

Mekanikaj Propraĵoj

Rekombinaj araneaj silkproteinoj (araneaj silkproteinoj) havas multajn eblajn aplikojn en la evoluo de novaj biomaterialoj, sed ilia multmodala kaj agreg-inklina naturo igas ilin malfacile akireblaj kaj facile uzeblaj.Ĉi tie ni raportas, ke rekombinaj miniaturaj spidroin-proteinoj kaj, grave, la N-fina domajno (NT) mem rapide formas memsubtenajn kaj travideblajn hidroĝelojn je 37 °C.fuzioproteinoj konsistantaj el NT kaj verda fluoreska proteino aŭ purinnukleozidfosforilazo formas plene funkciajn fuzioproteinojn.Hidroĝeloj.Niaj rezultoj montras, ke rekombinaj NT kaj fuzioproteinoj disponigas altajn esprimrendimentojn kaj dotas hidroĝelojn per allogaj propraĵoj kiel ekzemple travidebleco, geliĝo sen krucligo kaj rekta senmovigo de aktivaj proteinoj ĉe alta denseco.
Araneoj havas nekredeblajn sep malsamajn arojn de silkaj glandoj, ĉiu produktante specifan specon de silko.Ĉiuj sep silkspecioj estas kunmetitaj de araneaj silkproteinoj (spidroins) proksimume 6000 restaĵoj longaj kaj enhavas grandan centran ripetan regionon ĉirkaŭitan de sferaj N- kaj C-finaj domajnoj (NT kaj CT)1,2.La plej vaste studita speco de silko, la primara ampolo, estas produktita per la primara ampola glando.En ĉi tiu glando, monotavolo de epiteliĉeloj sintezas spidroin-proteinojn kaj sekrecias ilin en la lumenon de la glando, kie ili ĉeestas en solvebla formo (dopado) ĉe ekstreme altaj koncentriĝoj (30-50% p/v)3,4.La organizo kaj formo de la ĉefaj ampulaj spidroin-proteinoj en la glando estis diskutitaj, sed la plej multaj eksperimentaj indicoj indikas la ĉeeston de ĝenerale helikforma kaj/aŭ hazarda helikforma formo kaj micelar aŭ lamelaj strukturoj5,6,7,8,9,10.Dum la ripetemaj domajnoj reguligas mekanikajn trajtojn de silkaj fibroj, formante β-foliajn nanokristalojn kaj amorfajn strukturojn11,12,13,14,15, finaj domajnoj reguligas silkfibrojn en respondo al ŝanĝiĝantaj kondiĉoj laŭ la silka glando16,17,18.Kontrolante silkformadon, 19. Finaj domajnoj estas evolue konservitaj kaj ilia funkcio povas esti komuna al ĉiuj spidroin-proteinoj 2,20,21.Dum trairejo tra la glando, la pH de spidroin malpliiĝas de proksimume 7.6 ĝis < 5.716 kaj pliiĝas kun tondo kaj streĉado mediata per movado tra la iom post iom mallarĝiĝanta dukto.En solvaĵo, CT estas α-helikforma konstitua paralela dimero17, sed en respondo al malalta pH kaj tondfortoj, CT disvolviĝas kaj ŝanĝas β-tavolojn16, 17, eble ekigante β-tavolojn en la ripetemaj regionoj de Konverti 16. NT estas monomeraj sub. kondiĉoj reflektantaj kondiĉojn en la lumeno de la glando kaj mediacias la solveblecon de spidroino, sed ĉe reduktita pH, protonado de kelkaj karboksilacidaj flankĉenoj kondukas al dimerigo de NT kun pKa de proksimume 6.5, tiel stabiligante NT kaj fiksante spidroinon en grandaj. kvantoj.retoj16,18.Tiel, NT ludas ŝlosilan rolon en filamentformado, ŝanĝante de monomero en la tegaĵo al dimero en la fibro23,24,25.NT restas tre solvebla kaj helikforma sub ĉiuj kondiĉoj ĝis nun studitaj16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, kiuj inspiris ĝian evoluon kiel solv-plifortiga etikedo por la produktado de heterologaj proteinoj.
Rekombina mini-aranea silkproteino, konsistanta el unu NT, unu mallonga ripeta regiono, unu CT, kaj His6-etikedo (His-NT2RepCT) por purigo, estas same solvebla en akva bufro kiel indiĝena araneo-silkproteino kaj imitas indiĝenajn gravajn karakterizaĵojn de silka araneo. .kovrado 25.31.His-NT2RepCT povas esti ŝpinita en kontinuajn fibrojn uzante biomimetikan maŝinon en kiu pH 8 solvebla tegaĵo estas eltrudita en pH 525,32,33,34,35 akvobanon.Bioreactor fermentado de E. coli esprimanta His-NT2RepCT kaj posta post-traktado rezultigis >14 g/L-rendimenton post purigado.La alta rendimento, alta solvebleco kaj adekvata respondo de His-NT2RepCT al acidaj kondiĉoj estas ĉiuj atribuitaj al NT23, 25, 34.
Ĉi tie ni raportas la rapidan formadon de travideblaj hidroĝeloj de rekombinaj spidroin-proteinoj, inkluzive de NT sole, per kovado de proteinsolvo je 37 °C.Uzante tioflavina T fluoreskeco (ThT), Fourier-transformo infraruĝa spektroskopio (FTIR), nuklea magneta resonanca spektroskopio (NMR) kaj dissenda elektrona mikroskopio (TEM), ni trovis ke NT kaj mikroaraneoproteinoj spertas strukturan transformon en β-tukojn kaj amiloid-similajn fibrilojn. kiam ĝeloj formiĝas.Krome, fuzioproteinoj de NT kaj verda fluoreska proteino (GFP) aŭ purina nukleozidfosforilazo (PNP) formas hidroĝelojn kun plene funkciaj fuziofragmentoj.Alt-trafia esprimo en heterologaj gastigantoj, kunligita kun rapida formado de hidroĝeloj sub fiziologiaj kondiĉoj, malfermas la eblecon de kostefika produktado de hidroĝeloj kun realigitaj funkcioj.
Male al la plej multaj raportitaj rekombinaj spidroin-proteinoj36, His-NT2RepCT estas stabila en Tris-HCl-bufro ĉe pH 8 kaj povas esti koncentrita ĝis 500 mg/mL sen precipitaĵo25.Sekve, ni estis surprizitaj trovi, ke ĉi tiu proteino rapide formas optike klarajn, memsubtenajn hidrogelojn kiam kovita je 37 °C (Fig. 1b-d).Pliaj studoj montris, ke His-NT2RepCT-geliĝo okazis super ampleksa gamo de proteinaj koncentriĝoj (10-300 mg/mL) kaj ke ĉi tiu koncentriĝo estis inverse korelaciita kun geliĝotempo (Fig. 1c kaj Suplementa Fig. 1).Por ekscii, kiuj partoj de His-NT2RepCT medias hidroĝelan formadon, ni tiam ekzamenis ĉiun domajnon individue kaj en diversaj kombinaĵoj uzante flakan inversan analizon (Figuro 1a, b).Ĉiuj provitaj frakcioj de rekombina spidroin formis ĝelojn (ĉe proteina koncentriĝo de 300 mg/mL) en malpli ol 1 h, krom precipitita 2Rep (Fig. 1b).Ĉi tio sugestas, ke NT kaj CT sole, en kombinaĵo, aŭ asociitaj kun ripetoj, povas ĝeligi je 37 °C kaj ke la His6-etikedo ne influas ĉi tiun procezon laŭ iu ajn signifa mezuro.Surbaze de la komuna nocio ke NT estas tre solvebla kaj stabila proteino, kaj ke antaŭaj raportoj de rekombinaj spidroinhidroĝeloj atribuis ĝeligiefikojn al konformigaj ŝanĝoj en ripetaj regionoj kaj/aŭ CToj, NT mem povis.La malkovro de geliĝo estis neatendita.Suplementa Tabelo 1) 37, 38, 39. Rimarkinde, NT jam geliĝis ene de 10 minutoj ĉe koncentriĝo de ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Fioloj inversaj eksperimentoj kun diversaj koncentriĝoj de NT montris, ke je >50 mg/mL la NT-solvo geliĝis pli rapide ol His-NT2RepCT ĉe la responda koncentriĝo (w/v, Figuro 1c).
Skema reprezentado de diversaj spidroinkonstruaĵoj studitaj en tiu laboro.b Geltempo je 37 °C por diversaj rekombinaj spidroin-proteinoj (300 mg/mL) kontrolitaj renversante la fiolon.CT-ĝelo tuj sen kovado (<300 mg/mL), 2Rep precipitas (300 mg/mL, 5 mm skalo).c Gel-tempo de His-NT2RepCT kaj NT ĉe indikitaj proteinkoncentriĝoj je 37 °C.d Fotoj de His-NT2RepCT kaj NT-hidroĝeloj kun la araneo kaj la litero "NT" presitaj sube, respektive (ambaŭ 200 mg/mL, skalstango 5 mm).
Hidroĝeloj formitaj de diversaj rekombinaj spidroin-proteinoj havas iomete malsamajn kolorojn, kaj nudokula observado montras diversajn gradojn de travidebleco (Fig. 1b).NT-ĝeloj estas escepte klaraj dum aliaj ĝeloj iĝas maldiafanaj.His-NT2RepCT kaj NT-ĝeloj ĵetitaj en cilindrajn tubojn povus esti forigitaj de la ŝimo nerompita (Fig. 1d).
Por testi ĉu naturaj araneaj silkaj tegaĵoj ĝeliĝas sub kondiĉoj nun trovitaj kaŭzi geliĝon de la rekombinaj spidroinproteinoj, tegaĵoj estis kolektitaj de la granda ampola glando de la sveda pontaraneo ( Larinioides sclopetarius).Tegaĵoj estis stokitaj en 20 mM Tris-HCl-bufro je 50 mg/mL (surbaze de mezurita seka pezo), sed neniu geliĝo estis observita dum la 21-taga kovado je 37 °C (Suplementa Figuro 2a).
Por kvantigi tiujn ĝelojn, reologiaj mezuradoj povas esti uzitaj por studi la ĝeliĝprocezon kaj determini la totalajn mekanikajn trajtojn.Aparte, monitorado de la stokadmodulo (elasteco) ĉe levitaj temperaturoj povas disponigi informojn pri la geliga temperaturo same kiel la viskoelastaj trajtoj de la tegaĵo.Eksperimentoj pri altiĝo de temperaturo (uzante 1 °C/min je 25-45 °C, surbaze de antaŭaj studoj uzantaj naturajn silkajn akciajn solvojn)40,41 montris ke la stokadmoduloj de His-NT2RepCT kaj NT-solvoj pliiĝis kun pliiĝanta temperaturo.estis pliigita (Fig. 2 kaj Suplementa Fig. 3).Precipe, la NT-modulo komencis kreski je pli malalta temperaturo kompare kun His-NT2RepCT, kongrua kun la pli rapida ĝeltempo observita kiam NT estis rekte kovita kun His-NT2RepCT je 37 °C (Figuro 1).Post posta falo de temperaturo, la stoka modulo ne revenis al pli malaltaj valoroj kaj restis super la perda modulo (vidu Suplementan Fig. 3), indikante termike neinversigebla stabila geliĝo.Post geliĝo, la fina elasta modulo variis de 15 ĝis 330 kPa por His-NT2RepCT-hidroĝeloj ĉe koncentriĝo de 100-500 mg/mL, kaj la fina elasta modulo por NT-hidroĝeloj (100-500 mg/mL) variis de 2 ĝis 1400. kPa (Fig. , 2 kaj kompleta deklivdatumo) vidu Suplementan Fig. 3).
a Ŝanĝo en temperaturo dum mezuradoj de His-NT2RepCT (300 mg/mL) kaj b NT (300 mg/mL) kun skuado.La sagoj indikas la temperaturtendencon, kaj la pli malpeza ombriĝo de la datumoj de la stokadmodulo prezentas testadon je pli malaltaj tordmomantaj valoroj por la instrumento ol specifita de la fabrikanto, kio estas la kaŭzo de la pliigita bruo.c Finmodula amasiĝo de His-NT2RepCT kaj NT post levita temperaturo (100, 300 kaj 500 mg/mL).Ĉiuj modulaj legaĵoj estas prenitaj kun frekvenco de 0.1 Hz.
Kiel ebla metodo por esplori konformajn ŝanĝojn asociitajn kun geliĝo, ni registris FTIR-spektrojn de His-NT2RepCT kaj NT antaŭ kaj post geliĝo je 37 °C (Figuro 3a, b).Kiel atendite, la spektroj de His-NT2RepCT kaj NT-solvoj egalrilatis al proteinoj montrantaj α-helicon/hazardan bobenan sekundaran strukturon, kun okulfrapa bendo ĉe 1645 cm-1.Por ambaŭ hidroĝeloj, geliĝo rezultigis la formadon de du brakoj en la meza I-grupo je proksimume 1617 cm-1 kaj 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), indikante la formadon de kontraŭparalelaj β-folio strukturoj.Ĉi tiuj ŝanĝoj ankaŭ povas esti klare viditaj en la respektivaj dua derivaĵo kaj diferencaj geligaj spektroj (Suplementa Fig. 4b).La du grupoj de la NT-β-tavolo estis pli okulfrapaj ol tiuj de His-NT2RepCT, indikante ke la totala enhavo de β-tavolaj grupoj en la NT-hidroĝelo estis pli alta ol tiu de la NT2RepCT-hidroĝelo.
a FTIR-sorbadspektroj de His-NT2RepCT kaj b NT (ambaŭ 500 mg/mL) antaŭ (solvo) kaj post (ĝelo) kovado je 37 °C.c TEM-bildoj de resuspenditaj 50 mg/ml NT2RepCT-ĝeloj kaj d NT.Skalstango 200 nm.e Fibraj diametroj de His-NT2RepCT kaj NT-hidroĝeloj.n = 100 mezuritaj fibriloj, p < 0.0001.La eraraj stangoj montras la norman devion.La centro de la eraraj stangoj estas la meznombro.Neparigita t-testo (duvosta) estis uzita por statistika analizo.f ThT fluoreskeco de diversaj rekombinaj spidroin-proteinoj (100 mg/mL) je 37 °C sen skuado.g NT (100 mg/mL) inokulaj eksperimentoj de 100 mg/mL NT-ĝelo kun 0%, 5%, 10% kaj 20% semoj.
Analizo de la ĝelo per transdona elektrona mikroskopio (TEM) montris, ke la hidroĝelo konsistas el amiloid-similaj fibriloj (Fig. 3c, 3d).NT-formitaj fibriloj estis plilongigitaj (5-12 nm en diametro) kaj senbranĉaj, dum His-NT2RepCT-fibriloj estis pli mallongaj en longo kaj signife pli larĝaj en diametro (7-16 nm) (Fig. 3e).Ĉi tiuj rezultoj permesis al ni sekvi la kinetikon de fibrozo uzante la provon de tioflavina T (ThT).Por ĉiuj rekombinaj spidroin-proteinoj, la fluoreska signalo pliiĝis kiam specimenoj estis kovataj je 37 °C (Fig. 3f, Suplementa Fig. 5a).Konsekvence kun ĉi tiu trovo, mikroskopa ekzameno de NT kaj His-NT2RepCT sub geligaj kondiĉoj malkaŝis unuforman pliiĝon de ThT-fluoresko sen rimarkinda loka amasiĝo de ThT-pozitivaj agregaĵoj (Kuldona Fig. 5b, c).La formado de ThT-pozitivaj fibriloj ne estis akompanita de pliiĝo en NT kaj His-NTCT-malklareco (Suplementa Fig. 5d), kio signifas, ke reto de fibriloj en la ĝelo povus formiĝi sen kompromiti ĝelan klarecon.Semado per aldonado de malgrandaj kvantoj de antaŭformitaj fibriloj povas signife akceli fibrilformadon de kelkaj amiloidoj42,43,44 sed aldonante 5%, 10% aŭ 20% (w/w) NT al solvo de NT-hidrokoagulantoj.sema efiko (Fig. 3g).Eble ĉi tio estas pro la fakto, ke la fibriloj en la hidroĝelo estas relative fiksaj kaj ne povas esti uzataj kiel semoj.
La neatendita konduto de rekombinaj spidroin-proteinoj ĉe altaj temperaturoj instigis pliajn nuklean magnetan resonancan (NMR) spektroskopiostudojn por identigi konformigajn ŝanĝojn asociitajn kun ĝelformado.NMR-spektroj de His-NT2RepCT-solvoj registritaj dum tempo je 37 °C montris, ke CT ankoraŭ estis parte faldita, dum NT kaj 2Rep-signaloj malaperis (Fig. 4a), sugestante ke ĝi estis plejparte NT kaj 2Rep kiuj parte kontrolis formadon de His- NT2RepCT hidroĝelo.La CT-signalo ankaŭ estis mildigita al 20% de sia origina intenseco, sugestante ke CT ankaŭ estas plejparte fiksita kaj integrigita en la hidroĝela strukturo.Por pli malgranda parto de la CT, kiu estas same movebla kiel en la antaŭinkubata provaĵo kaj tiel observita per solva NMR, al la spektroj mankas signaloj por la unuaj 10 strukturitaj restaĵoj, eble pro malfacila senmovigo de la alkroĉita parto de His-NT2Rep.La NMR-spektroj de la -stato de hidroĝeloj -NT2RepCT malkaŝis la superregan ĉeeston de α-helicoj kaj β-tavoloj kaj, en pli malgranda mezuro, la hazarda bobenformiĝo (Fig. 4b).Kemia ŝanĝanalizo de metioninrestaĵoj ĉeestantaj nur en NT montris ke tiu domajno estis konvertita al β-folia strukturo.La temp-dependaj spektroj de NT en solvaĵo montris unuforman malkreskon en signala intenseco (Fig. 4c), kaj solid-stata NMR de NT-hidroĝeloj montris, ke la plej multaj el la NT-restaĵoj estis konvertitaj al β-foliaj strukturoj (Fig. 4d).La formo de 2Rep ne povus esti determinita aparte pro ĝia tendenco al agregado.Tamen, la solidstataj NMR-spektroj de la hidroĝeloj NTCT kaj His-NT2RepCT aspektis tre similaj (Fig. 4b; Suplementa Fig. 6b), sugestante, ke 2Rep malmulte kontribuis al la struktura parto de la hidroĝelo His-NT2RepCT.Por CT-hidroĝeloj, α-helicoj, β-folioj kaj hazardaj helikformaj sekundaraj strukturoj estis trovitaj ekzisti (Suplementa Fig. 6d).Tio indikas ke kelkaj partoj de la CT restas α-helicoj dum aliaj iĝas β-tukoj.Tiel, la rezultoj de NMR-spektroskopio indikas ke NT estas grava por hidroĝela formado kaj ankaŭ transformas en β-talan konformiĝon sur fuzio kun 2Rep kaj CT.Konsekvence kun ĉi tio, ni ĵus trovis, ke amiloidaj spacaj zipoj verŝajne formiĝas en ĉiuj kvin helicoj de la NT-domajno, kaj la Waltz-algoritmo antaŭdiris amiloidogenan regionon en helico 1 (Fig. 4e).
2D-spektroj de 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT-solvo antaŭ (blua) kaj 19 horojn post kovado (ruĝa) je 37 °C.Individuaj krucaj pintoj en la ruĝa spektro kaj F24, G136, polyA en la blua spektro estas indikitaj per unuliteraj aminoacidsimboloj kaj restnombroj.La enigaĵoj montras la dependecon de la signalintenso ĝustatempe por elektitaj restaĵoj de la NT, 2Rep, kaj CT-domajnoj.b Solidsubstancaj radiofrekvencaj (RFDR) spektroj de His-NT2RepCT-hidroĝeloj.Korelacioj de Cα/Cβ-restaĵoj observitaj en RFDR-spektroj estis determinitaj kompare kun modelaj peptidaj kemiaj ŝanĝoj kaj valoroj derivitaj de statistikoj82,83 kaj iliaj malĉefaj strukturoj.SSB - turnanta flanka bando.c Unudimensiaj spektroj de 15N-HSQC 10 mg/mL NT-solvo dum kovado je 37 °C dum 36 horoj.La enmetaĵo montras volumetran intensecon kontraŭ tempo.d Solidsubstancaj RFDR-spektroj de NT-hidroĝeloj.La korelacioj de Cα/Cβ-restaĵoj kaj iliaj sekundaraj strukturoj observitaj en la RFDR-spektroj estas indikitaj.e Surbaze de la NT45.79-fibrila inklina profilo de la Zipper-datumbazo (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).La Rosetta energio de la spaca fulmoŝanĝfenestro de la heksapeptido estas montrita en kcal/mol.Ruĝaj strioj indikas heksapeptidojn kun alta fibrozo-inklino (Rosetta energio sub -23 kcal/mol; sub la punktlinio).Verdaj stangoj indikas fragmentojn kun Rosetta energioj super la sojlo kaj tial malpli verŝajne formi sterajn zipojn.Fragmentoj enhavantaj prolinon estis ekskluditaj de la analizo (sen kolumnoj).Kvadratoj indikas areojn de amiloidozo antaŭdiritaj de la Waltz-algoritmo81 (https://waltz.switchlab.org).La sekvenco de aminoacidrestaĵoj de NT estas ĉe la pinto, kaj la specoj de restaĵoj trovitaj en la β sekundara strukturo (determinita per solidsubstanca NMR-spektroskopio) estas montritaj en ruĝa.La pozicioj de la kvin NT α-helicoj estas indikitaj kiel (H1-H5)28.
Je pH <6.5, HT dimeriĝas, estante imuna al denaturado induktita de varmo aŭ ureo18.Por pliklarigi kiel NT-dimerigo kaj stabileco influas geliĝon, solvoj enhavantaj 100 mg/ml NT estis kontrolitaj ĉe pH 8, 7, kaj 6 uzante la fiolon inversan teston.NT-provaĵoj kovataj ĉe pH 8 kaj 7 geliĝis post 30 min je 37 °C, sed la pH 8-ĝelo restis klara, dum la pH 7-ĝelo montris videblan precipitaĵon (Fig. 5a).Kontraste, solvo enhavanta HT je pH 6 ne formis ĝelon, kaj granda precipitaĵo povus esti vidita post 20 min je 37 °C.Tio indikas ke dimeroj mem kaj/aŭ ilia pli alta stabileco komparite kun monomeroj malhelpas geliĝon.La formado de precipitaĵo por NT je pH 7 kaj 6 ne estis atendita, ĉar estis raportite, ke NT estas solvebla je 200 mg/ml27, facile refaldas post varmeca denaturado, kaj ankaŭ konservas α-helicon ĉe pli malaltaj valoroj de. pH 18. Verŝajna klarigo por ĉi tiuj diferencoj estas, ke la antaŭe raportitaj eksperimentoj estis faritaj ĉe ĉambra temperaturo aŭ malsupre, aŭ ĉe relative malaltaj proteinaj koncentriĝoj16,18,19.
Testo de inversigo de NT-fiolo (100 mg/mL) ĉe pH 8, 7, 6 kaj 154 mM NaCl (pH 8) post kovado je 37 °C.b NT KD-spektroj kun kaj sen 154 mM NaF kaj 154 mM NaCl, respektive.Molara elipseco je 222 Nm estas konvertita al proporcio de naturaj faldoj.c NT inversa analizo (100 mg/mL) NT* (37 °C kaj 60 °C), NTA72R (37 °C), kaj His-NT-L6 (37 °C kaj 60 °C).d KD-spektroj de NT-mutaciuloj NT*, NTA72R, kaj His-NT-L6.Molara elipseco je 222 Nm estas konvertita al proporcio de naturaj faldoj.e Inversa testo de NTFlSp, NTMiSp kaj reduktita NTMiSp (100 mg/mL).Skalstango 5 mm.f KD-spektroj de NT, NTFlSp, NTMiSp kaj reduktita NTMiSp.Molara elipseco je 222 Nm estas konvertita al proporcio de naturaj faldoj.Plenaj NT-spektroj je 25 °C kaj 95 °C estas montritaj en Suplementa Figuro 8.
Fiziologia salkoncentriĝo determinas elektrostatikajn interagojn inter NT-subunuoj kaj dimerigon de NT-translokigo al pli malalta pH18.Ni trovis, ke la ĉeesto de 154 mM NaCl kaj NaF ja malhelpis geliĝon, respektive (Fig. 5a, b; Suplementa Fig. 2b) kaj ke ĉi tiuj saloj pliigis la termikan stabilecon de NT-monomeroj (Fig. 5b, Suplementa Fig. 8) .Ĝi ankaŭ sugestas, ke stabilecplibonigo, prefere ol dimeriĝo, malhelpas ĝelformadon.
Por plu esplori la rolon de proteina dimeriĝo kaj stabileco en geliĝo, ni uzis du mutaciulojn, NT* kaj NTA72R, kiuj ankaŭ restas monomeraj ĉe malalta pH28.30.NT÷ estas duobla ŝargo-inversiga mutaciulo en kiu la ŝajna dupolusa ŝargdistribuo de la monomero estas platigita, kiu malhelpas dimerigon kaj draste pliigas monomerstabilecon.NTA72R estas ŝargita dipolo, sed Arg-anstataŭigita Ala situas ĉe la dimerlimo, tiel ke mutacioj influas subunuinteragojn necesajn por dimerigo.Post kovado je 37 °C, NT* ne formis hidroĝelon, dum NTA72R formis opakan ĝelon dum 15 min (Fig. 5c).Ĉar kaj NT* kaj NTA72R ne povas dimeriĝi sed diferencas en monomera stabileco (Fig. 5d), ĉi tiuj rezultoj forte sugestas, ke alta termodinamika stabileco malhelpas NT geliĝi.Ĉi tio ankaŭ estas subtenata de la fakto, ke HT* formas ĝelon kiam ĝi estas malstabila ĉe alta temperaturo (post 8 min je 60 °C; Fig. 5c).Antaŭe estis montrite ke la alta enhavo de metionino en NT likvigas sian naturan faldaĵon kaj ke ses Met al Leu-anstataŭaĵoj (referitaj ĉi tie kiel His-NT-L6) forte stabiligas la NT46-monomeron.Surbaze de la supozo, ke struktura fleksebleco estas postulata por NT-ĝelformado, ni trovis, ke la stabila mutaciulo His-NT-L6 ne ĝelis je 37 °C (Figuro 5c, d).Tamen, His-NT-L6 ankaŭ formis ĝelon post kovado ĉe 60°С dum 60 min (Fig. 5c).
La kapablo de NT transformi en β-tukojn strukturojn kaj formi hidroĝelojn ŝajnas validi por kelkaj sed ne ĉiuj la NT-domajnoj de spidroino.NTs de malsamaj silkaj specoj kaj araneospecioj, Trichonephila clavipes (NTFlSp), formis ĝelojn malgraŭ ilia relative malalta metionina enhavo kaj alta termika stabileco (Fig. 5e, f kaj Suplementa Tabelo 2).Kontraste, NT de la malgranda ampula proteina spidroino de Araneus ventricosus (NTMiSp) kun malalta termika stabileco kaj alta enhavo de metionino ne formis hidrogelojn (Aldona Tabelo 2 kaj Fig. 5e, f).Ĉi-lasta povas esti asociita kun la ĉeesto de intramolekulaj disulfidaj ligoj29,47.Konsekvence, kiam la disulfidaj ligoj de NTMiSp estis reduktitaj, ĝi formis hidrogelon post kovado je 37 ° C dum 10 min (Fig. 5e).Konklude, oni devas rimarki, ke struktura fleksebleco estas grava, sed ne la sola, kriterio por la formado de ĝelo el NT.Alia faktoro kiu povas esti grava estas la tendenco formi amiloidajn fibrilojn, kaj analizo kun la zipdatumbazo kaj la Waltz-algoritmo montris korelacion inter la kapablo formi ĝelojn kaj la ĉeesto de amiloidogenaj regionoj, same kiel la amplekson de la antaŭdirita regionoj. por formi sterajn zipojn.Estis korelacio (Aldona Tabelo 2 kaj Suplementa Fig. 9).
La kapablo de NT formi fibrilojn kaj formi ĝelojn sub favoraj kondiĉoj igis nin hipotezi ke NT-fuzioj kun aliaj proteinfragmentoj daŭre povas formi ĝelojn kun plena funkcio de fuziopartneroj.Por testi tion, ni enkondukis verdan fluoreskan proteinon (GFP) kaj purinnukleozidan fosforilazon (PNP) ĉe la C-finaĵo de la NT, respektive.La rezultaj fuzioproteinoj estis esprimitaj en E. coli kun tre altaj finaj rendimentoj (150 mg/L kaj 256 mg/L skuadflakon kulturoj por His-NT-GFP kaj His-NT-PNP, respektive), kongruaj kun kio estis montrita. por Aliaj proteinoj kunfanditaj al NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) kaj His-NT-PNP (100mg/mL) kunfandaj proteinoj formis ĝelojn post 2 horoj kaj 6.5 horoj je 37 °C kaj, grave, la GFP-frakcio restis senŝanĝa.observita post gelado, kun> 70% de la komenca fluoreskeca intenseco restanta post gelado (Fig. 6a).Por mezuri PNP-agadon en his-NT-PNP-solvoj kaj ĝeloj, ni devis dilui la fuzian proteinon kun NT ĉar la enzimeca agado de la pura preparo estis ekster la detekta intervalo de la analizo ĉe geligaj koncentriĝoj.La ĝelo formita kun miksaĵo enhavanta 0.01 mg/mL His-NT-PNP kaj 100 mg/mL NT retenis 65% de la komenca enzima aktiveco de la preinkubataj specimenoj (Fig. 6b).La ĝelo restis nerompita dum la mezurado (Suplementa Fig. 10).
Relativa fluoreskeca intenseco antaŭ kaj post geliĝo de His-NT-GFP (300 mg/mL) kaj inversa fiolo enhavanta His-NT-GFP-hidroĝelon (300 mg/mL) sub videbla kaj UV-lumo.Punktoj montras individuajn mezuradojn (n = 3), eraraj stangoj montras norman devion.La averaĝa valoro estas montrita en la centro de la eraraj stangoj.b PNP-agado estis akirita per fluorometria analizo uzante solvojn kaj ĝelojn konsistantajn el NT (100 mg/ml) kaj miksaĵo enhavanta 0,01 mg/ml his-NT-PNP kaj 100 mg/ml Novaj Tajvano-dolaroj.La enmetaĵo montras inversan fiolon enhavantan hidroĝelon enhavantan His-NT-PNP (5 mm skalstango).
Ĉi tie, ni raportas la formadon de hidroĝeloj de NT kaj aliaj rekombinaj spidroin-proteinoj per kovado de proteinsolvo je 37 °C (Figuro 1).Ni montras, ke gelado estas asociita kun la transformo de α-helicoj en β-tavolojn kaj la formado de amiloid-similaj fibriloj (Fig. 3 kaj 4).Ĉi tiu trovo estas surpriza ĉar NToj estas bobenitaj globformaj kvin-helikaj pakaĵoj konataj pro sia ekstreme alta solvebleco kaj alta stabileco ĉe koncentriĝoj >200 mg/mL je 4 °C dum pluraj tagoj27.Krome, NToj facile refaldas post varmecmalnaturado ĉe malaltaj proteinkoncentriĝoj en µM.Laŭ niaj rezultoj, fibrilformado postulas kombinaĵon de> 10 mg/mL proteina koncentriĝo kaj iomete levita temperaturo (Fig. 1).Ĉi tio kongruas kun la ideo, ke amiloidaj fibriloj povas formiĝi el globe falditaj proteinoj, kiuj estas en parte disfaldita stato pro termikaj fluktuoj sub fiziologiaj kondiĉoj 48 .Ekzemploj de proteinoj kiuj spertas ĉi tiun konvertiĝon inkluzivas insulin49,50, β2-mikroglobulin, transtiretinon kaj lizozimon51,52,53.Kvankam NT estas α-helico en sia denaska stato, proksimume 65% de la polipeptida ĉeno estas kongrua kun sterika zipoformado (Fig. 4e) 45 .Ĉar la monomero estas dinamike movebla46, ĝi povas elmontri ĉi tiujn eblajn amiloidogenajn regionojn ĉe modere altaj temperaturoj kaj ĉe altaj koncentriĝoj de totala proteino povas atingi kritikan koncentriĝon por amiloida fibroformado54.Sekvante ĉi tiun rezonadon, ni trovis negativan korelacion inter spidroin-koncentriĝo kaj geliĝa tempo (Fig. 1c), kaj se la monomera NT-formiĝo estas stabiligita aŭ per mutacioj (NT*, His-NT-L6) aŭ per sala aldono, povas malhelpi la formado hidroĝeloj (Fig. 5).
Plejofte, amiloidaj fibriloj malaperas el solvaĵo kiel precipitaĵo, sed sub certaj kondiĉoj ili povas formi hidroĝelojn55,56,57.Hidrogel-formaj fibriloj tipe havas altan bildformaton kaj formas stabilajn tridimensiajn retojn per molekula implikiĝo,55,58 kongrua kun niaj rezultoj.Por hidroĝela formado en vitro, proteinoj ofte estas plene aŭ parte disvolvitaj, ekzemple, per eksponiĝo al organikaj solviloj, alta temperaturo (70-90 °C) kaj/aŭ malalta pH (1.5-3.0)59,60,61,62.La spidroin-hidroĝeloj priskribitaj ĉi tie ne postulas severan prilaboradon, nek ili postulas krucligajn agentojn por stabiligi la hidroĝelojn.
Antaŭe estis raportite ke spidroin-ripetoj kaj QD, kiuj ŝajnas sperti β-tukon ŝanĝas dum silka ŝpinado, formas hidroĝelojn.Kompare kun niaj trovoj, kovadotempoj kaj/aŭ kovadotemperaturoj estis respektive signife pli longaj aŭ pli altaj, kaj la rezultaj hidroĝeloj ofte estis maldiafanaj (Figuro 7 kaj Suplementa Tabelo 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68. , 69. Krom rapidaj ĝeltempoj, NT-hidroĝeloj >300 mg/mL (30%) superis ĉiujn aliajn priskribitajn rekombinajn araneajn silkproteinhidroĝelojn, same kiel naturajn hidroĝelojn kiel gelateno, alginato (2%), agaro (0,5 %). ) kaj kolageno.(0,6%) (Figuro 7 kaj Suplementaj Tabeloj 1 kaj 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
La ĝeltempo kaj elasta modulo de la hidroĝeloj en ĉi tiu studo estis komparitaj kun aliaj spidroin-bazitaj hidroĝeloj kaj elektitaj naturaj hidroĝeloj.Referencoj estas donitaj kune kun priskribo de la geladkondiĉoj.APS Amonia persulfato, ĉambra temperaturo.Datumoj 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Araneoj ŝajnas esti evoluiginta manierojn malhelpi spidroin ĝeliĝado dum stokado.Malgraŭ la alta koncentriĝo de proteino en la silka glando, la granda ripeta regiono asociita kun la fina domajno signifas, ke la ŝajna koncentriĝo de NT kaj CT en la glando egalrilatas al proksimume 10-20 mg/ml, ĉe la limo de ĉi tiu studo.necesa por in vitro observita hidroĝela formado.Krome, similaj koncentriĝoj de saloj 16 stabiligis NT, kiel en silkaj glandoj (Fig. 5b).NT-formiĝo estis studita en la E. coli-citosolo kaj trovita esti pli malloze faldita ol kiam ekzamenite en vitro, plue indikante ke salo aŭ aliaj faktoroj malhelpas ĝian agregadon en vivo.Tamen, la kapablo de NTs transformi en β-foliojn povas esti grava por filamentformado kaj devus esti esplorita en estontaj studoj.
Krom la novaj aspektoj de NT-amiloid-simila fibrilo kaj hidroĝela formado observitaj en ĉi tiu studo, ni ankaŭ montras, ke ĉi tiu fenomeno povas havi bioteknologiajn kaj biomedicinajn aplikojn (Fig. 8).Kiel pruvo de koncepto, ni kombinis NT kun GFP aŭ PNP kaj montris, ke la fuzia proteino ankaŭ formas hidroĝelojn kiam kovita je 37 °C kaj ke la GFP kaj PNP-frakcioj plejparte konservas sian agadon post geliĝo (Figuro 6).Nukleozidfosforilazoj estas gravaj kataliziloj sintezo de nukleozidaj analogoj75, kio faras nian eltrovaĵon grava por la biofarmacia industrio.La koncepto de esprimado de fuzioproteinoj kiuj formas travideblajn hidroĝelojn sub favoraj kondiĉoj permesas la kreadon de funkciigitaj hidroĝeloj kun favoraj trajtoj por larĝa gamo de aplikoj kiel ekzemple enzimsenmovigo, kontrolita drogliberigo kaj hista inĝenierado.Krome, NT kaj NT* estas efikaj esprimsignoj30, kio signifas, ke NT kaj ĝiaj variaĵoj povas esti uzataj por altprodukta produktado de solveblaj fuzioproteinoj kaj posta kreado de senmovigitaj celproteinoj en 3D hidroĝeloj.
NT estas solvebla, α-helikforma kaj stabila ĉe malaltaj koncentriĝoj (µM) kaj 37 °C.Je la sama temperaturo, sed ĉe kreskantaj koncentriĝoj (>10 mg/ml), NT formas ĝelojn konsistantajn el amiloid-similaj fibriloj.NT-fuzioproteinoj ankaŭ formas fibrilarĝelojn kun plene funkciaj fuziofragmentoj, permesante al diversaj proteinoj esti senmovigitaj en 3D hidroĝeloj uzantaj NT.Fundo: NT (PDB: 4FBS) kaj ilustraĵoj de fibraj retoj kaj rilataj proteinstrukturoj (supozitaj kaj ne desegnitaj al skalo, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
La konstrukcioj (vidu Suplementan Tabelon 4 por kompleta listo inkluzive de aminoacidsekvencoj) estis klonitaj en plasmidon pT7 kaj transformitaj en E. coli BL21 (DE3).E. coli enhavantaj inĝenieritajn plasmidojn estis inokulitaj en Luria buljono kompletigita kun kanamicino (70 mg/l) kaj kreskigita dum la nokto je 30 °C kaj 250 rpm.La kulturo tiam estis inokulita 1/100 en LB-medion enhavanta kanamicinon kaj kulturita je 30 °C kaj 110 rpm ĝis la OD600 atingis 0.8.Por NMR-studoj, bakterioj estis kultivitaj en M9 minimuma medio enhavanta 2 g da D-glukozo 13C (Aldrich) kaj 1 g da amonia klorido 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) por proteinetikedado kun izotopoj.Malaltigu la temperaturon al 20 celsiusgradoj kaj induktu proteinan esprimon per 0,15 mM isopropiltiogalaktopiranozido (fina koncentriĝo).Post tranokta protein-esprimo, ĉeloj estis rikoltitaj je 7278 × g, 4 °C dum 20 min.Ĉelaj buletoj estis resuspenditaj en 20 mM Tris-HCl, pH 8, kaj frostigitaj ĝis plua uzo.Degelitaj ĉeloj estis lizitaj uzante ĉelrompilon (TS-seriomaŝinoj, Constant Systems Limited, Anglio) je 30 kPa.Tiam la lisatoj estis centrifugitaj je 25,000 g dum 30 minutoj je 4 °C.Por NTMiSp, la buleto tiam estis resuspendita en 2 M ureo, 20 mM Tris-HCl, pH 8, kaj sonikita dum 2 min (2 s on/off, 65%), tiam centrifugata denove je 25,000 xg, 4 ° C. 30 min.La supernatant estis ŝarĝita sur Ni-NTA-kolumno, lavis kun 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, kaj finfine la proteino estis eluita kun 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Por generi NT2RepCT kaj NTCT, trombindigestado enkondukas la ejon (ThrCleav) inter His kaj NT.Trombinaj fendejoj ankaŭ ĉeestas en His-NT-ThrCleav-2Rep (produktas 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produktas NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produktas CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (produktas NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produktas NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produktas NTF1Sp), kaj His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produktas NTMiSp).La konstrukcioj estis digestitaj kun trombino (1:1000) kaj dializitaj dum la nokto je 4° C. kun 20 mM Tris-HCl, pH 8, uzante Spectra/Por dializmembranon kun molekula pezosojlo de 6-8 kDa.Post dializo, la solvo estas ŝarĝita sur Ni-NTA-kolumno kaj la elfluo enhavanta la interesan proteinon estas kolektita.Proteinkoncentriĝoj estis determinitaj per mezurado de UV-sorbado je 280 nm uzante la formortan koeficienton de ĉiu proteino, krom NTF1Sp, kiu uzis la Bradford-analizon laŭ la protokolo de la produktanto.Pureco estis determinita per SDS-poliakrilamida (4-20%) ĝelelektroforezo kaj Coomassie brila blua makulo.Proteinoj estis koncentritaj per centrifugilfiltriloj (VivaSpin 20, GE Healthcare) je 4000 xg kun 10 kDa molekula pezo-tranĉo en 20-minutaj cikloj.
Degelu la proteinan solvon kaj zorge enpipetu 150 µl en 1 ml klaran septan fiolon (8 x 40 mm Thermo Scientific).La tuboj estis kovritaj kaj sigelitaj kun parafilmo por malhelpi vaporiĝon.Specimenoj (n = 3) estis kovataj je 37 °C aŭ 60 °C kaj periode inversigitaj por observi geliĝon.Provaĵoj kiuj ne ĝelis estis kovataj dum almenaŭ unu semajno.Reduktu NTMiSp-disulfidligojn kun 10 mM DTT per 10 µM proteino.Por analizi la geliĝon de naturaj araneaj silkaj tegaĵoj, la sveda pontaraneo estis tranĉita, la du ĉefaj ampulitaj glandoj estis metitaj en 200 μl da 20 mM Tris-HCl-bufro pH 8 kaj tranĉitaj por permesi al la tegaĵo apartiĝi de la glandoj..La enhavo de la glandoj estas solvita en bufro, 50 µl por determino de seka pezo (per kovado de malfermaj fioloj je 60 °C ĝis konstanta pezo) kaj 150 µl por ĝeligado je 37 °C.
La mezura geometrio/ilo estas farita el neoksidebla ŝtalo uzante paralelan platon kun supra diametro de 20 mm kaj interspaco de 0,5 mm.Varmigu la provaĵon de 25 °C ĝis 45 °C kaj reen al 25 °C kun rapideco de 1 °C je minuto uzante rustorezistanŝtalan malsupran Peltier-platon.Vibraj mezuradoj estis faritaj kun ofteco de 0.1 Hz kaj en la lineara viskoelasta regiono de la materialo ĉe streĉo de 5% kaj 0.5% por specimenoj de 100 mg/mL kaj 300-500 mg/mL, respektive.Uzu kutiman humidecan ĉambron por malhelpi vaporiĝon.Datenoj estis analizitaj uzante Prism 9.
Por kolektado de infraruĝaj (IR) spektroj ĉe ĉambra temperaturo de 800 ĝis 3900 cm–1.La ATR-aparato, same kiel la malpeza vojo tra la spektrometro, estas elpurigitaj per seka filtrita aero antaŭ kaj dum la eksperimento.Solvoj (500 mg/mL por minimumigi akvosorbadpintojn en la spektroj) estis pipetitaj sur la kristalojn, kaj ĝeloj (500 mg/mL) estis formitaj antaŭ mezurado kaj poste transdonitaj al la kristaloj (n = 3).1000 skanadoj estis registritaj kun rezolucio de 2 cm-1 kaj nula devociklo de 2. La dua derivaĵo estis kalkulita uzante OPUS (Bruker) uzante glatigan gamon de naŭ poentoj.La spektroj estis normaligitaj al la sama integriĝregiono inter 1720 kaj 1580 cm-1 uzante F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".En ATR-IR-spektroskopio, la penetrprofundo de infraruĝa trabo en provaĵon estas ondonumero dependa, rezultigante pli fortan sorbadon ĉe pli malaltaj ondonombroj ol ĉe pli altaj ondonumeroj.Tiuj efikoj ne estis korektitaj por la spektroj montritaj en Fig.3 ĉar ili estas tre malgrandaj (Suplementa Fig. 4).Korektitaj spektroj por ĉi tiu figuro estis kalkulitaj per la Bruker OPUS-programaro.
Principe, ampleksa kvantigo de proteinformiĝoj estas ebla post fidinda dekonvolucio de la komponentoj ene de la amida I-pinto.Tamen, kelkaj obstakloj aperas en la praktiko.Bruo en la spektro povas aperi kiel (falsaj) pintoj dum malkonvolucio.Krome, la pinto pro akvofleksado koincidas kun la pozicio de la amida I-pinto kaj povas havi similan grandecon por provaĵoj enhavantaj grandan kvanton da akvo, kiel ekzemple la akva ĝelo studita ĉi tie.Tial, ni ne provis tute malkomponi la amidan I-pinton, kaj niaj observaĵoj devus nur esti pripensitaj en subteno de aliaj metodoj kiel ekzemple NMR-spektroskopio.
Solvoj de 50 mg/ml NT kaj His-NT2RepCT estis geligitaj dum la nokto je 37 °C.La hidroĝelo tiam estis diluita kun 20 mM Tris-HCl (pH 8) al koncentriĝo de 12.5 mg/ml, bone skuita kaj pipetita por rompi la ĝelon.Poste, la hidroĝelo estis diluita 10 fojojn per 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl de la specimeno estis aplikitaj al kupra krado kovrita per formvar, kaj la troa specimeno estis forigita per bloving papero.Provaĵoj estis lavitaj dufoje kun 5 µl da MilliQ-akvo kaj makulitaj per 1% uranilformato dum 5 minutoj.Forigu troan makulon per sorba papero, poste sekigas la maŝon per aero.Bildigo estis farita sur ĉi tiuj kradoj uzante FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN funkciantan ĉe 100 kV.La bildoj estis registritaj ĉe x 26,500 kaj x 43,000 pligrandigoj uzante Veleta 2k × 2k CCD-fotilon (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germanio).Por ĉiu specimeno (n = 1), 10-15 bildoj estis registritaj.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) estis uzata por bildanalizo kaj mezurado de fibro-diametroj (n = 100, malsamaj fibroj).Prismo 9 kutimis fari neparigitajn t-testojn (duvostaj).La averaĝaj His-NT2RepCT kaj NT-fibriloj estis 11.43 (SD 2.035) kaj 7.67 (SD 1.389) nm, respektive.La konfida intervalo (95%) estas -4,246 ĝis -3,275.gradoj de libereco = 198, p < 0,0001.
80 µl da likvaj specimenoj enhavantaj 10 µM tioflavin T (ThT) estis mezuritaj triope (n = 3) sub senmovaj kondiĉoj uzante Corning 96-bone nigrajn malsuprajn klarajn malsuprajn platojn (Corning Glass 3881, Usono).Fluoreskdiferencoj estis registritaj uzante 440 nm ekscitfiltrilon kaj 480 nm emisiofiltrilon (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenburg, Germanio).La ThT-signalo estis nek saturita nek estingita, ĉar eksperimentoj kun malsamaj koncentriĝoj de ThT estis faritaj sen ŝanĝi la signalintensecon.Rekordu absorbadon je 360 ​​Nm por mezurado de nebuleto.Por semado de eksperimentoj, 100 mg/mL-ĝeloj estis formitaj je 37° C., resuspenditaj, kaj uzataj por semado ĉe molaj proporcioj de 5%, 10% kaj 20%.Datenoj estis analizitaj uzante Prism 9.
Degelu akciojn de His-NT2RepCT kaj NT>100 mg/mL sur glacio kaj filtru tra 0.22 µm filtrilo.Koncentriĝoj estis kalkulitaj per mezurado de absorbo je 280 nm uzante Nanodrop.En putoj de 96-puto nigra ne-deviga plato (Corning) kun klara fundo, specimenoj estis diluitaj al 20 mg/ml en 20 mM Tris-HCl pH 8 kaj miksitaj kun 5 μM ThT (fina koncentriĝo), totala specimena koncentriĝo. 50 μl volumo.Provaĵoj estis bildigitaj ĉiujn 10 minutojn je 37 °C sur CellObserver (Zeiss) mikroskopo kun elsendita lumkanalo kaj FITC-ekscito kaj emisiofiltriloj por ThT-bildigo.20x/0.4 lenso estas uzata por bildigo.Zen Blue (Zeiss) kaj ImageJ (https://imagej.nih.gov/) estis uzitaj por bildanalizo.Ĝeloj ankaŭ estis preparitaj el NT kaj His-NT2RepCT-solvoj je koncentriĝo de 50 mg/mL enhavanta 20 mM Tris pH 8 kaj 5 µM ThT kaj kovataj je 37 °C dum 90 min.La ĝelpecoj estis translokigitaj al nova puto enhavanta 20 mM Tris, pH 8, kaj 5 μM ThT en ne-liganta nigra 96 ​​puto klara fundplato.Akiru verdan fluoreskecon kaj brilkampajn bildojn je 20x/0.4 pligrandigo.ImageJ estis uzita por bildanalizo.
Solvo NMR-spektroj estis akiritaj ĉe 310 K sur 600 MHz Bruker Avance Neo-spektrometro ekipita per QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-provaĵoj enhavantaj 10 mg/mL homogenan proteinon etikeditan kun 13C, 15N, solvita en 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Kemiaj ŝanĝoj de NT2RepCT ĉe pH 6.7 kutimis atribui pinton 23 en la 2D spektro de 15N-HSQC.
Magia angulo turniĝantaj solidaj NMR (MAS) spektroj de 13C, 15N-etikeditaj hidroĝeloj estis registritaj sur Bruker Avance III HD-spektrometro ĉe 800 MHz ekipita per 3.2 mm 13C/15N{1H} senelektrona sondilo.Specimentemperaturo estis kontrolita uzante ŝanĝiĝeman temperaturan gasfluon je 277 K. Dudimensia dipola rotacia resonanco (DARR) 76 kaj radiofrekvenca rekonekto (RFDR) 77 spektroj estis akiritaj ĉe MAS-frekvencoj de 12.5 kHz kaj 20 kHz, respektive.Krucpolusiĝo (CP) de 1H ĝis 13C estis farita per lineara deklivirejo de 60.0 ĝis 48.0 kHz ĉe 1H, 61.3/71.6 kHz ĉe 13C (ĉe 12.5/20 kHz MAS) kaj kontaktotempo 0.5-1 ms.Spinal6478-malkuplado ĉe 73.5 kHz estis uzita dum datenkolektado.La akirtempo estis 10 milisekundoj kaj la cikloprokrasto estis 2.5 sekundoj.La unu-ligitaj Cα/Cβ-korelacioj observitaj en la RFDR-spektroj estis asignitaj surbaze de la karakterizaj restaĵ-specaj kemiaj ŝanĝoj kaj multobl-ligitaj korelacioj en la DARR-spektroj.
La Zipper79-datumbazo (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) estis uzata por taksi flutemojn kaj Rosetta energion por NT, NTFlSp kaj NTMiSp.La Zipper-datumbazo komputas Rosetta Energy80, kiu kombinas plurajn liberajn energiajn funkciojn por modeligi kaj analizi proteinstrukturon.Energionivelo de -23 kcal/mol aŭ pli malalta indikas altan tendencon al fibrilado.La pli malalta energio signifas pli da stabileco de la du β-fadenoj en la zipoformo.Krome, la Waltz-algoritmo estis uzita por antaŭdiri amiloidogenajn regionojn en NT, NTFlSp kaj NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
La NT-proteina solvo estis miksita kun 2-(N-morfolino) etansulfona acido (MES) bufro ĉe pH 5.5 kaj 6.0 por malaltigi la pH al pH 6 kaj 7, respektive.La fina proteina koncentriĝo estis 100 mg/ml.
Mezuradoj estis faritaj sur J-1500 KD-spektrometro (JASCO, Usono) uzante 300 μL-kuveton kun optika vojo de 0.1 cm.Proteinoj estis diluitaj al 10 μM (n = 1) en 20 mM fosfata bufro (pH 8).Por analizi proteinan stabilecon en la ĉeesto de salo, proteinoj estis analizitaj ĉe la sama koncentriĝo (n = 1) en 20 mM fosfatbufro (pH 8) enhavanta 154 mM NaF aŭ NaCl, respektive.Temperaturaj skanadoj estis registritaj je 222 nm de 25 °C ĝis 95 °C kun hejtado de 1 °C/min.La proporcio de denaske falditaj proteinoj estis kalkulita per la formulo (KDmeasure - KDfinal)/(KDstart - KDfinal).Krome, kvin spektroj estis registritaj por ĉiu specimeno de 260 nm ĝis 190 nm je 25 °C kaj post varmigado ĝis 95 °C.Kvin spektroj estis averaĝigitaj, glatigitaj kaj transformitaj al molara elipseco.Datenoj estis analizitaj uzante Prism 9.
La fluoreskeca intenseco de His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) estis mezurita triope (n = 3) en 96-putoj Corning-platoj kun nigra travidebla fundo (Corning Glass 3881, Usono) sub senmovaj kondiĉoj.Mezuru specimenojn per fluoreskec-bazita platleganto kun ekscita ondolongo de 395 nm kaj registri la emision je 509 nm antaŭ geliĝo kaj 2 horojn poste je 37 °C.Datenoj estis analizitaj kun Prism 9.
Purina nukleozida fosforilaza agado-testkompleto (fluorometria metodo, Sigma Aldrich) estis uzita laŭ la instrukcioj de la produktanto.Por mezuri agadon en ĝeloj kaj solvoj enhavantaj His-NT-PNP, miksu 10 ng de His-NT-PNP kun 100 mg/mL NT al totala volumeno de 2 µL ĉar la ĝelo donis signalon super la detekta intervalo de la aro.Kontroloj por ĝeloj kaj solvoj sen His-NT-PNP estis inkluditaj.La mezuradoj estis faritaj dufoje (n = 2).Post kiam la agado estis mezurita, la reagmiksaĵo estis forigita kaj la ĝelo fotita por certigi ke la ĝelo restis sendifekta dum la mezurado.Datenoj estis analizitaj uzante Prism 9.
Por pliaj informoj pri studa dezajno, vidu la Naturstudan abstraktaĵon ligitan al ĉi tiu artikolo.
Figuroj 1 kaj 2 prezentas la komencajn datumojn.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, kaj 6, Suplementaj Figoj.3, suplementa fig.5a, d, suplementa fig.6 kaj suplementa fig.8. Datumoj de ĉi tiu studo estas gastigitaj en la Zenodo-datumbazo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.La NMR-datumoj akiritaj en ĉi tiu studo estis afiŝitaj al la deponejo BMRBig sub la enira ID bmrbig36.La strukturoj de GFP kaj PNP estis prenitaj de PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. kaj Johansson, J. Ŝpinante artefaritan aranean silkon.Nacia Kemiaĵo.biologio.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.La Nephila clavipes genaro elstarigas la diversecon de araneaj silkgenoj kaj ilian kompleksan esprimon.Nacia Genette.49, 895–903 (2017).