347 12.7*1.24mm Neoksidebla ŝtalo volvita tubo, Molekula mekanismo de sinkrona elektrostatika kondensado kaj kunagregado de α-synuclein kaj tau

Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Glitiloj montrante tri artikolojn per diapozitivo.Uzu la malantaŭan kaj sekvan butonojn por moviĝi tra la lumbildoj, aŭ la butonojn de glit-regiloj ĉe la fino por moviĝi tra ĉiu lumbildo.

347 Stainless Steel Pipe Specification

347 12.7 * 1.24mm Neoksidebla ŝtalo bobenita tubo

Ekstera Diametro: 6.00 mm OD ĝis 914.4 mm OD, Grandecoj ĝis 24” NB haveblaj Eks-stoko, OD-grandaj Ŝtalaj Tuboj haveblaj Eks-stoko

SS 347 Tuba Dikeca Gamo: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ktp. (0.5-12mm) Aŭ ne-regula grandeco por esti tajlorita laŭbezone

Tipo: SS 347 Senjuntaj Pipoj |SS 347 ERW Pipoj |SS 347 Velditaj Pipoj |SS 347 Fabrikitaj Pipoj |SS 347 CDW Tuboj, LSAW Pipoj / Kudro-veldita / Redesegnita

Formo: SS 347 Rondaj Pipoj/Tuboj, SS 347 Kvadrataj Pipoj/Tuboj, SS 347 Rektangula Pipo/Tuboj, SS 347 Volvita Tuboj, SS 347 "U" Formo, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hidraŭlikaj Tuboj

Longo: Unuopa Hazarda, Duobla Hazarda & Bezonata Longa Fino: Simpla Fino, Beveled Fino, Tretita

Finprotekto: Plastaj Ĉapoj |Ekstera Finaĵo: 2B, No.4, No.1, No.8 Spegula Finaĵo por Neoksideblaj Ŝtalaj Pipoj, Finiĝu laŭ kliento Postuloj

Livera Kondiĉo: Rekuzita kaj Piklita, Polurita, Brila Rekucita, Malvarmetirita

Inspektado, Testaj Raportoj: Muelejaj Testaj Atestiloj, EN 10204 3.1, Kemiaj Raportoj, Mekanikaj Raportoj, PMI-Testo-Raportoj, Vidaj Inspektadaj Raportoj, Triaj Partiaj Inspektadaj Raportoj, Aprobita Laboratorio-Raportoj de NABL, Detrua Testo-Raporto, Nedetruaj Testaj Raportoj

Pakado: Pakita en Lignaj Kestoj, Plastaj Sakoj, Ŝtalaj Strioj Bundigitaj, aŭ laŭ Klientoj Petoj

Specialaĵoj: Grandoj kaj Specifoj krom supre povas esti fabrikitaj laŭ peto

SS 347 Pipo Grandeca Gamo: 1/2 coloj NB, OD ĝis 24 coloj

ASTM A312 347: Senjunta kaj rekta-kudro veldita aŭstenita tubo destinita por alta temperaturo kaj ĝenerala koroda servo.Pleniga metalo ne permesata dum veldado.

ASTM A358 347: Elektra fuzio veldita aŭstenitika tubo por koroda kaj/aŭ alta temperatura servo.Tipe nur pipo ĝis 8 coloj estas produktita laŭ tiu specifo.Aldono de pleniga metalo estas permesita dum veldado.

ASTM A790 347: Senjunta kaj rekta-kudro veldita ferita/aŭstenita (dupleksa) tubo destinita por ĝenerala koroda servo, kun speciala emfazo de rezisto al streĉa koroda krakado.

ASTM A409 347: Rekt-kudro aŭ spiral-kudro elektra fuzio veldita granda diametra aŭstenita lummura tubo en grandecoj 14" ĝis 30" kun muroj Sch5S kaj Sch 10S por koroda kaj/aŭ alta

ASTM A376 347: Senjunta aŭstenitika pipo por alttemperaturaj aplikoj.

ASTM A813 347: Unu-kudro, unu- aŭ duobla-veldita aŭstenita tubo por alta temperaturo kaj ĝeneralaj korodaj aplikoj.

ASTM A814 347: Malvarme prilaborita veldita aŭstenita tubo por alta temperaturo kaj ĝenerala koroda servo.

347H Neoksidebla Ŝtalo Pipoj Kemia Kunmetaĵo

Neoksidebla Ŝtalo 347H Pipo Mekanikaj Propraĵoj

Neoksidebla Ŝtalo 347H Pipoj Fizikaj Propraĵoj

Ekvivalentaj Gradoj por 347H Neoksidebla Ŝtala Pipo

Amiloida alfa-sinuclein (αS) agrego estas markostampo de Parkinson-malsano kaj aliaj sinucleinopatioj.Lastatempe, la tau-proteino ofte asociita kun Alzheimer-malsano estis asociita kun αS-patologio kaj trovita ko-lokalizi en αS-riĉaj inkludoj, kvankam la molekula mekanismo de kunagregado de la du proteinoj restas neklara.Ni raportas ĉi tie, ke la fazo αS disiĝas en likvajn kondensaĵojn per elektrostatika kompleksa kondensado kun pozitive ŝargitaj polipeptidoj kiel tau.Depende de la afineco de αS por polikatjonoj kaj la indico de valentmalplenigo de la koagulreto, emboloj spertas rapidan geliĝon aŭ kunfluon sekvitan per malrapida amiloida agregado.Kombinante serion de altnivelaj biofizikaj teknikoj, ni povis karakterizi la likvan-likvan αS/Tau-fazan apartigon kaj identigi la ŝlosilajn faktorojn, kiuj kondukas al la formado de heterogenaj agregaĵoj enhavantaj ambaŭ proteinojn en likva proteina kondensaĵo.
Aldone al membransekcioj, spaca apartigo en ĉeloj ankaŭ povas esti atingita per la formado de protein-riĉaj, likv-similaj densaj korpoj nomitaj biomolekulaj kondensaĵoj aŭ gutetoj, tra procezo konata kiel likva-likva faza apartigo (LLPS).Tiuj gutetoj estas formitaj per multvalentaj tempaj interagoj, kutime inter proteinoj aŭ proteinoj kaj RNA, kaj servas gamon da funkcioj en preskaŭ ĉiuj vivantaj sistemoj.Granda nombro da LLP-kapablaj proteinoj elmontras sekvencojn de malalta komplekseco kiuj estas tre malordaj en naturo kaj en la formado de biomolekulaj kondensaĵoj3,4,5.Multaj eksperimentaj studoj rivelis la flekseblan, ofte senordan, kaj multvalentan naturon de la proteinoj kiuj konsistigas tiujn likv-similajn kondensaĵojn, kvankam malmulto estas konata ĉirkaŭ la specifaj molekulaj determinantoj kiuj kontrolas la kreskon kaj maturiĝon de tiuj kondensaĵoj al pli solid-simila. stato..
La novaj datumoj subtenas la hipotezon, ke aberra protein-movita LLPS kaj transformo de gutetoj en solidajn strukturojn povas esti signifaj ĉelaj vojoj kondukantaj al la formado de nesolveblaj toksaj agregaĵoj kiuj ofte estas markostampoj de degeneraj malsanoj.Multaj LLPS-rilataj interne malordaj proteinoj (IDPoj), ofte tre ŝargitaj kaj flekseblaj, estis longe asociitaj kun neŭrodegenero tra la procezo de amiloida agregado.Aparte, biomolekulaj IDP-kondensaĵoj kiel ekzemple FUS7 aŭ TDP-438 aŭ proteinoj kun grandaj malaltaj kompleksecdomajnoj kiel ekzemple hnRNPA19 pruviĝis maljuniĝi en ĝel-similajn aŭ eĉ solidajn formojn tra procezo nomita fluidigo.kunmetaĵo.al solidfaza transiro (LSPT) kiel funkcio de tempo aŭ en respondo al certaj post-tradukaj modifoj aŭ patologie signifaj mutacioj1,7.
Alia IDP asociita kun LLPS en vivo estas Tau, mikrotubul-rilata malorda proteino kies amiloida agregado estis implikita en Alzheimer-malsano10 sed ankaŭ lastatempe estis implikita en Parkinson-malsano (PD) kaj aliaj sinaptaj nukleaj proteinopatioj 11, 12, 13 estas rilataj.Oni pruvis ke Tau spontanee disiĝas de solvaĵo/citoplasmo pro favoraj elektrostatikaj interagoj14, rezultigante la formadon de taŭ-riĉigitaj gutetoj konataj kiel elektrostatikaj koacervatoj.Estis ankaŭ observite ke tiu speco de nespecifa interago estas la mova forto malantaŭ multaj biomolekulaj kondensaĵoj en naturo15.Koncerne tau-proteinon, elektrostatika agregado povas esti formita per simpla agregado, en kiu kontraŭe ŝargitaj regionoj de la proteino ekigas la interfendoprocezon, aŭ per kompleksa agrego per interagado kun negative ŝargitaj polimeroj kiel ekzemple RNA.
Lastatempe, α-synuclein (αS), amiloida IDP implikita en PD kaj aliaj neŭrodegeneraj malsanoj kolektive konataj kiel sinucleinopatio17,18, estis montrita en ĉelaj kaj bestaj modeloj19,20 koncentritaj en proteinkondensaĵoj kun fluid-simila konduto.En vitro-studoj montris, ke αS spertas LLPS per simpla agregado per ĉefe hidrofobaj interagoj, kvankam ĉi tiu procezo postulas escepte altajn proteinkoncentriĝojn kaj maltipe longajn kovadotempojn19,21.Ĉu la αS-enhavantaj kondensaĵoj observitaj en vivo estas formitaj per ĉi tiu aŭ aliaj LLPS-procezoj restas ŝlosila nesolvita afero.Simile, kvankam αS-amiloida agregado estis observita en neŭronoj en PD kaj aliaj sinucleinopatioj, la preciza mekanismo de kiu αS spertas intraĉelan amiloidan agregadon restas neklara, ĉar troesprimo de tiu proteino ne ŝajnas ekigi tiun procezon memstare.Kroma ĉela difekto ofte estas postulata, sugestante ke certaj ĉelaj lokoj aŭ mikromedioj estas postulataj por la renukleado de intraĉelaj αS-amiloidaj asembleoj.Unu ĉela medio kiu estas precipe inklina al agregado povas esti la interno de proteinkondensaĵoj 23 .
Kurioze, αS kaj tau estis trovitaj samlokigi en karakterizaj malsaninkludoj en homoj kun Parkinson-malsano kaj aliaj sinucleinopatioj 24,25 kaj eksperimentoj raportis sinergian patologian rilaton inter la du proteinoj 26,27 sugestante eblan rilaton inter agrego αS kaj tau en neŭrodegeneraj malsanoj.malsano.Oni trovis, ke αS kaj tau interagas kaj antaŭenigas reciproke la agregadon en vitro kaj en vivo 28,29 kaj heterogenaj agregaĵoj kunmetitaj de ĉi tiuj du proteinoj estis observitaj en la cerboj de pacientoj kun sinucleinopatioj 30 .Tamen, malmulto estas konata ĉirkaŭ la molekula bazo de la interagado inter αS kaj tau kaj la mekanismo de ĝia kunagregado.αS estis raportita interagi kun tau tra elektrostatika altiro inter la tre negative ŝargita C-fina regiono de αS kaj la centra prolin-riĉa regiono de tau, kiu ankaŭ estas riĉigita en pozitive ŝargitaj restaĵoj.
En ĉi tiu studo, ni montras, ke αS ja povas disociiĝi en gutetojn per elektrostatika kompleksa kondensado en la ĉeesto de tau-proteino, kontraste al ĝia interago kun aliaj pozitive ŝargitaj polipeptidoj kiel poli-L-lizino (pLK), kaj en ĉi tiu procezo.αS funkcias kiel eŝafoda molekulo por la gutetoreto.Ni identigis rimarkindajn diferencojn en la procezo de maturiĝo de elektrostataj αS koacervatoj, kiuj estas asociitaj kun diferencoj en la valento kaj forto de la interago de proteinoj implikitaj en la koacervata reto.Kurioze, ni observis kunagregadon de αS kaj tau-amiloidaj proteinoj en longvivaj likvaj koacervatoj kaj identigis kelkajn ŝlosilajn faktorojn, kiuj kondukas al kunagregado de ĉi tiuj du proteinoj en tiaj koacervatoj.Ĉi tie ni detale priskribas ĉi tiun procezon, kiu estas ebla molekula mekanismo subesta la kolokigo de du proteinoj en malsano-specifaj inkludoj.
αS havas tre anjonan C-finan voston ĉe neŭtra pH (Fig. 1a), kaj ni hipotezis, ke ĝi povus suferi LLPS per la kondensado de elektrostatikaj kompleksoj kun polikatjonaj malordaj polipeptidaj molekuloj.Ni uzis 100-restaĵan poli-L-lizinon (pLK) kiel la komencan modelmolekulon pro ĝia pozitive ŝargita kaj senorda polimera naturo ĉe neŭtrala pH 32. Unue, ni konfirmis, ke pLK interagas kun la Ct-domajno de αS per Solva NMR-spektroskopio. (Figuro 1b) uzante 13C/15N-etikeditan αS en ĉeesto de kreskantaj αS:pLK-molaraj proporcioj.La interagado de pLK kun la Ct-domajno de αS manifestiĝas en perturboj de la kemia ŝanĝo kaj malkresko en la pintintenseco en tiu regiono de la proteino.Interese, kiam ni miksis αS kun pLK je αS koncentriĝo de ĉ.5–25 µM en ĉeesto de polietilenglikolo (5–15% PEG-8) (tipa LLPS-bufro: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) ni tuj iris tra larĝa kampo de proteinformado .gutetoj estis observitaj per fluoreskeco (WF) kaj hela kampo (BF) mikroskopio (Fig. 1c).1-5 µm gutetoj enhavantaj koncentritan αS (aldonita 1 µM AlexaFluor488-etikedita αS, AF488-αS), iliaj elektrostatikaj trajtoj povas esti derivitaj de sia rezisto al 10% 1,6-heksanodiolo (1,6-HD) kaj ĝia sentemo al pliiĝo en NaCl-koncentriĝo (Fig. 1c).La fluid-simila naturo de la koacervatoj de la elektrostatika komplekso αS/pLK estas pruvita per ilia kapablo kunfandi ene de milisekundoj (Fig. 1d).Uzante turbidimetrion, ni kvantigis la formadon de gutetoj sub ĉi tiuj kondiĉoj, konfirmis la elektrostatikan naturon de la ĉefa interago asociita kun ĝia stabileco (Fig. 1e), kaj taksis la efikon de diversaj polimerproporcioj sur la LLPS-procezo (Fig. 1f).Kvankam gutetformacio estas observita super larĝa gamo de polimerproporcioj, la proceso estas tre favora kiam pLK estas pli ol αS.LLP-oj ankaŭ estis observitaj uzante la kemie malsaman delokantan agenton dekstrano-70 (70 kDa) aŭ uzante gamon da provaĵformatoj, inkluzive de vitroglitadgutoj, mikroplatputoj de diversaj materialoj, Eppendorf aŭ kvarcokapilaroj.
Skema reprezentado de malsamaj proteinaj regionoj en la variantoj WT-αS kaj ΔCt-αS uzataj en ĉi tiu studo.La amfipata N-fina domajno, la hidrofoba amiloid-formanta (NAC) regiono, kaj la negative ŝargita C-fina domajno estas montritaj en blua, oranĝa, kaj ruĝa, respektive.La Net Charge Per Residual (NCPR) mapo de WT-αS estas montrita.b NMR-analizo de la αS/pLK-interago en la foresto de makromolekulaj aretoj.Ĉar pLK-koncentriĝo pliiĝas (αS:pLK molarproporcioj de 1:0.5, 1:1.5, kaj 1:10 estas montritaj en helverda, verda, kaj malhelverda, respektive).c Koacervu αS/pLK (mola proporcio 1:10) je 25 µM (1 µM AF488-etikedita αS aŭ Atto647N-etikedita pLK por WF-bildigo) en LLPS-bufro (supro) aŭ kompletigita kun 500 mM NaCl (malsupre maldekstre) aŭ post 110 % 1,6-heksanodiolo (1,6-HD; malsupre dekstre).Skalstango = 20 µm.d Reprezentaj mikroskopaj bildoj de BF-guteto-fuzio de αS/pLK (molara proporcio 1:10) ĉe koncentriĝo de 25 μM;sagoj indikas la kunfandiĝon de individuaj gutoj (ruĝaj kaj flavaj sagoj) en novan guton (oranĝa sago) ene de 200 ms).Skalstango = 20 µm.e Luma disvastigo (je 350 nm) αS/pLK-agregado en LLPS-bufro antaŭ kaj post aldono de 500 mM NaCl aŭ 10% 1,6-HD ĉe 25 µM αS (N = 3 specimenaj kopioj, averaĝa kaj norma devio ankaŭ indikis).f BF-bildo (supro) kaj malpeza disvastiga analizo (ĉe 350 nm, malsupre) de αS/pLK-agregado ĉe 25 μM αS kun kreskanta αS:pLK-mola proporcio (N = 3 specimenaj kopioj, averaĝa kaj norma devio ankaŭ indikis).Skalstango = 10 µm.La skalbreto sur unu bildo indikas la skalon de ĉiuj bildoj en unu panelo.Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
Surbaze de niaj observoj de αS/pLK elektrostatika kompleksa kondensado kaj antaŭaj observoj de αS kiel klienta molekulo de la tau/RNA-kondensado per rekta interagado kun tau31, ni hipotezis, ke αS kaj tau povus kunapartigi kun la solvilo en la foresto de RNA. kondensado.tra elektrostatikaj kompleksoj, kaj αS estas la skafalda proteino en αS/Tau koacervatoj (vidu tau-ŝarĝdistribuon en Figuro 2e).Ni observis, ke kiam 10 μM αS kaj 10 μM Tau441 (enhavantaj 1 μM AF488-αS kaj 1 μM Atto647N-Tau, respektive) estis miksitaj kune en LLPS-bufro, ili facile formis proteinajn agregaĵojn enhavantajn ambaŭ proteinojn, kiel vidite de WF-mikroskopio.(Fig. 2a).La kolokigo de la du proteinoj en la gutetoj estis konfirmita per konfoka (CF) mikroskopio (Suplementa Fig. 1a).Simila konduto estis observita kiam dekstrano-70 estis uzata kiel agrega agento (Suplementa Fig. 1c).Uzante aŭ FITC-etikeditan PEG aŭ dekstranon, ni trovis, ke ambaŭ amasaj agentoj estis egale distribuitaj tra la specimenoj, montrante nek apartigon nek asocion (Kuldona Fig. 1d).Prefere, ĝi sugestas, ke en ĉi tiu sistemo ili antaŭenigas fazan apartigon per makromolekulaj amasigaj efikoj, ĉar PEG estas prefere stabila amasiga agento, kiel vidite en aliaj LLP-sistemoj33,34.Ĉi tiuj protein-riĉaj gutetoj estis sentemaj al NaCl (1 M) sed ne al 1,6-HD (10% v/v), konfirmante siajn elektrostatikajn ecojn (Suplementa Fig. 2a, b).Ilia fluida konduto estis konfirmita per observado de milisekundaj kunfandaj gutetaj eventoj uzante BF-mikroskopion (Fig. 2b).
a Konfokusaj (CF) mikroskopiobildoj de αS/Tau441 koacervas en LLPS-bufro (10 μM de ĉiu proteino, 0.5 μM de AF488-etikedita αS kaj Atto647N-etikedita Tau441).b Reprezentaj diferenciga interferkontrasto (DIC) bildoj de αS/Tau441 gutetaj fuziokazaĵoj (10 μM por ĉiu proteino).c Fazdiagramo bazita sur malpeza disvastigo (je 350 nm) de Tau441 LLPS (0-15 µM) en la foresto (maldekstre) aŭ ĉeesto (dekstre) de 50 µM αS.Pli varmaj koloroj indikas pli da disvastigo.d Luma disvastigo de αS/Tau441 LLPS-provaĵoj kun kreskanta αS-koncentriĝo (Tau441 ĉe 5 µM, N = 2-3 specimenaj ripetoj kiel indikite).e Skema reprezentado de kelkaj tau-proteinvariaĵoj kaj malsamaj regionoj de la proteino uzita en ĉi tiu studo: negative ŝargita N-fina domajno (ruĝa), prolin-riĉa regiono (blua), mikrotubul-liga domajno (MTBD, elstarigita en oranĝo), kaj spiralforma paro amiloide.filamentregionoj (PHF) situantaj ene de la MTBD (griza).La mapo de Net Charge Per Residue (NCPR) de Tau441 estas montrita.f Uzante 1 µM AF488-etikeditan αS kaj Atto647N-etikeditan ΔNt-, uzante 1 µM AF488-etikeditan αS aŭ ΔCt-αS en la ĉeesto de ΔNt-Tau (supro, 10 µM per proteino) aŭ K18 (malsupro, µM per 50 µM per proteino). ) ) ) mikrografioj de WF densigita en LLPS aŭ K18-bufro.La skalstangoj en unu bildo reprezentas la skalon de ĉiuj bildoj en unu panelo (20 µm por paneloj a, b kaj f).Krudaj datumoj por paneloj c kaj d estas provizitaj kiel krudaj datumoj dosieroj.
Por testi la rolon de αS en ĉi tiu LLPS-procezo, ni unue esploris la efikon de αS sur guto-stabileco per nefelometrio uzante kreskantajn koncentriĝojn de NaCl (Fig. 2c).Ju pli alta estas la salokoncentriĝo en la specimenoj enhavantaj αS, des pli altaj estas la malpezaj valoroj (je 350 nm), kio indikas la stabiligan rolon de αS en ĉi tiu LLPS-sistemo.Simila efiko povas esti observita pliigante la αS-koncentriĝon (kaj tial la αS:Tau441-proporcion) al ĉ.10-obla pliiĝo rilate al la tau-koncentriĝo (5 µM) (Fig. 2d).Por pruvi, ke αS estas skafalda proteino en koacervatoj, ni decidis esplori la konduton de la LLPS-interrompita Tau-mutaciulo, al kiu mankas negative ŝargita N-fina regiono (restaĵoj 1-150, vidu Fig. 2e) nomita ΔNt-Tau.WF-mikroskopio kaj nefelometrio konfirmis, ke ΔNt-Tau mem ne spertis LLPS (Fig. 2f kaj Suplementa Fig. 2d), kiel antaŭe raportis 14. Tamen, kiam αS estis aldonita al dispersaj solvoj de ĉi tiu detranĉita Tau-variaĵo, la LLPS-procezo estis tute. reestigita kun gutetodenseco proksime al la gutetodenseco de plenmezuraj solvoj de Tau kaj αS sub similaj kondiĉoj kaj proteinkoncentriĝoj.Ĉi tiu procezo ankaŭ povas esti observita sub kondiĉoj de malalta makromolekula amasiĝo (Kuldona Fig. 2c).La rolo de la C-fina αS-regiono, sed ne ĝia tuta longo, en la LLPS-procezo estis pruvita per inhibicio de gutetformado uzante C-finan stumpigitan αS-variaĵon malhavantan restaĵojn 104-140 (Fig. 1a) de la (ΔCt-). αS) proteino (Fig. 2f kaj Suplementa Fig. 2d).La kolokigo de αS kaj ΔNt-Tau estis konfirmita per konfoka fluoreskeca mikroskopio (Suplementa Fig. 1b).
Por plue testi la LLPS-mekanismon inter Tau441 kaj αS, plia Tau-variaĵo estis uzita, nome la parigita helikforma filamentkerno (PHF) fragmento en la mikrotubul-liga domajno (MTBD), kiu se ĝi enhavas kvar karakterizajn ripetdomajnojn, ofte ankaŭ konatajn. kiel la K18-fragmento (vidu Fig. 2e).Estis lastatempe raportite ke αS prefere ligas al tau-proteino situanta en prolin-riĉa domajno en sekvenco kiu antaŭas la mikrotubul-devigan domajnon.Tamen, la PHF-regiono ankaŭ estas riĉa je pozitive ŝargitaj restaĵoj (vidu Figuro 2e), precipe lizino (15% restaĵoj), kiu instigis nin testi ĉu ĉi tiu regiono ankaŭ kontribuas al la kondensado de la komplekso αS/Tau.Ni observis, ke K18 sole ne povis ekigi LLPS ĉe koncentriĝoj ĝis 100 μM sub la provitaj kondiĉoj (LLPS-bufro kun 15% PEG aŭ 20% dekstrano) (Figuro 2f).Tamen, kiam ni aldonis 50 µM αS al 50 µM K18, rapida formado de proteinaj gutetoj enhavantaj K18 kaj αS estis observita per nefelometrio (Suplementa Fig. 2d) kaj WF-mikroskopio (Fig. 2f).Kiel atendite, ΔCt-αS ne povis restarigi la LLPS-konduton de K18 (Fig. 2f).Ni rimarkas, ke αS/K18-agregado postulas iomete pli altajn proteinajn koncentriĝojn por indukti LLPS kompare kun αS/ΔNt-Tau aŭ αS/Tau441, aliaj aferoj estas egalaj.Ĉi tio kongruas kun pli forta interago de la αS C-fina regiono kun la proline-riĉa Tau-domajno kompare kun la mikrotubul-liga domajno, kiel priskribite antaŭe 31 .
Konsiderante ke ΔNt-Tau ne povas plenumi LLPS en foresto de αS, ni elektis ĉi tiun Tau-variaĵon kiel modelon por karakterizi αS/Tau LLPS pro ĝia simpleco en LLPS-sistemoj kun plenlonga Tau (izotipo, Tau441/Tau441).kun kompleksaj (heterotipaj, αS/Tau441) agregaciaj procezoj.Ni komparis la gradon de αS-agregado (kiel parto de la densigita faza proteino, fαS,c) en la sistemoj αS/Tau kaj αS/ΔNt-Tau per centrifugado kaj disigita faza SDS-PAGE-analizo (vidu 2e), trovis tre similajn valorojn. por ĉiuj proteinoj en la sama koncentriĝo.Aparte, ni akiris fαS,c 84 ± 2% kaj 79 ± 7% por αS/Tau kaj αS/ΔNt-Tau, respektive, sugestante, ke la heterotipa interago inter αS kaj tau estas supera al la interago inter tau-molekuloj.inter.
La interagado kun diversaj polikatjonoj kaj la efiko de la kondensadprocezo sur la αS kinetiko unue estis studitaj per la fluoreskeca reakiro post fotoblankigado (FRAP) metodo.Ni testis αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau kaj αS/pLK koacervatojn (100 μM αS kompletigitaj kun 2 μM αS AF488-αS kaj 100 μM Tau441 aŭ ΔNt-Tau aŭ 1 mM pLK).Datumoj estis akiritaj en la unuaj 30 minutoj post miksado de la specimenaj komponantoj.De reprezentaj FRAP-bildoj (Fig. 3a, αS/Tau441-kondensado) kaj iliaj respondaj tempkurbaj kurboj (Fig. 3b, Suplementa Fig. 3), oni povas vidi ke αS-kinetiko estas tre simila al tiuj de Tau441-koacervatoj.kaj ΔNt-Tau, kiu estas multe pli rapida kun pLK.La kalkulitaj difuzkoeficientoj por αS ene de la koacervato laŭ FRAP (kiel priskribite fare de Kang et al. 35) estas D = 0.013 ± 0.009 µm2/s kaj D = 0.026 ± 0.008 µm2/s por αS/Tau441 kaj αNt-S por/Δ la sistemo αS/.pLK, Tau kaj D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, respektive (Fig. 3c).Tamen, la disvastigkoeficiento αS en la disigita fazo estas pluraj grandordoj pli alta ol ĉiuj densigitaj fazoj, kiel determinite de Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, vidu Suplementan Fig. 3) sub la samaj kondiĉoj (LLPS-bufro) sed en la foresto de polikatjonoj. ( D = 8 ± 4 µm2/s).Tial, la kinetiko de αS-traduko estas signife reduktita en koacervatoj komparite kun proteinoj en la disigita fazo pro okulfrapaj molekulaj amasefikoj, kvankam ĉiuj koacervatoj retenas likvaĵ-similajn trajtojn dum la unua duonhoro post sia formado, kontraste al la tau-fazo.pli rapida kinetiko en pLK-kondensaĵo.
a–c FRAP-analizo de αS-dinamiko (2% AF488-etikedita αS) en elektrostatikaj koacervatoj.Reprezentaj bildoj de αS/Tau441 FRAP-analizoj triope estas montritaj en (a), kie ruĝaj cirkloj indikas senkolorigitajn areojn.La skalstango estas 5 µm.b Mezumaj FRAP-kurboj kaj (c) kalkulitaj disvastigkoeficientoj (D) por 5-6 (N) malsamaj gutetoj de tri eksperimentoj uzante 100 µM αS kaj ekvimolarajn koncentriĝojn de Tau441 (ruĝa) aŭ ΔNt-Tau (blua) aŭ pLK (verda) je dekoble la koncentriĝo de LLPS.La norma devio de la FRAP-kurbo estas montrita en ombrita koloro.Por komparo, la disvastigkoeficiento αS en la disigita fazo estis determinita triope uzante fluoreskecan korelacian spektroskopion (FCS) (vidu Suplementan Figuro 3 kaj metodojn por pliaj informoj).d Kontinuaj X-bandaj EPR-spektroj de 100 μM TEMPOL-122-αS en LLPS-bufro sen iu polikatjono (nigra) aŭ en ĉeesto de 100 μM Tau441 (ruĝa) aŭ ΔNt-Tau (blua) aŭ 1 mM pLK (verda).La enmetita montras pligrandigitan vidon de la fortaj kampolinioj kie okazas la plej dramaj ŝanĝoj.e Ligaj kurboj de 50 μM TEMPOL-122-αS kun diversaj polikatjonoj en foresto de LLPS (sen PEG).La reduktita amplitudo de grupo III kompare kun grupo II (IIII/III) de la normaligita EPR-spektro pruviĝas pliigi la molarajn proporciojn de Tau441 (ruĝa), ΔNt-Tau (blua) kaj pLK (verda).Koloraj linioj montras taŭgan al datumoj uzante malglatan ligmodelon kun n identaj kaj sendependaj ligejoj sur ĉiu kurbo.Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
Kiel komplemento, ni esploris la dinamikon de αS en diversaj koacervatoj uzante direktitan spin-etikedadon (SDSL) kaj kontinuan elektronan paramagnetan resonancon (CW-EPR).Ĉi tiu metodo pruvis esti tre utila por raporti la flekseblecon kaj dinamikon de la IDP kun realisma resta rezolucio36,37,38.Tiucele ni konstruis cisteinajn restaĵojn en unuopaj Cys-mutaciuloj kaj uzis la spinondilon 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxyl (TEMPOL).Maleimidaj derivaĵoj etikedas ilin.Pli specife, ni enigis TEMPOL-sondilojn ĉe pozicio 122 aŭ 24 αS (TEMPOL-122-αS kaj TEMPOL-24-αS).En la unua kazo, ni celas la C-finan regionon de la proteino, kiu estas implikita en interagado kun polikatjonoj.Anstataŭe, pozicio 24 povas doni al ni informojn pri la totala dinamiko de la proteinoj en la kondensaĵo.En ambaŭ kazoj, la EPR-signaloj akiritaj por proteinoj de la disigita fazo egalrilatis al nitroksidradikaluloj en la rapide moviĝanta ŝtato.Post faza apartigo en la ĉeesto de tau aŭ pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 aŭ ΔNt-Tau kun proporcio de 1:1 aŭ pLK kun proporcio de 1:10), pliiĝo en la relativa pintintenseco estis observita en la EPR-spektro de αS.La perdlinio plilarĝiĝis, indikante reduktitan αS-reorientiĝokinetikon en gutetoj kompare kun proteino en diluita fazo (Fig. 3d, Suplementa Fig. 4a).Ĉi tiuj ŝanĝoj estas pli prononcitaj ĉe pozicio 122. Dum ĉe pozicio 24 la ĉeesto de pLK ne influis la kinetikon de la sondilo, ĉe pozicio 122 la spektra linioformo ŝanĝiĝis signife (Suplementa Fig. 4a).Kiam ni provis modeligi la spektrojn ĉe la pozicio 122 de du sistemoj αS/polication uzante la izotropan modelon (Kuldona Figuro 5a) kutime uzata por priskribi la dinamikon de spin-etikedita IDP38,39, ni ne povis rekonstrui la eksperimentajn spektrojn..Spektra simulado de la pozicio de 24 spinoj kontrastoj (Suplementa Fig. 5a).Tio indikas ke ekzistas preferaj pozicioj en la spaco de spinkonfiguracioj de la C-fina regiono de αS en la ĉeesto de polikatjonoj.Konsiderante la frakcion de αS en la densigita fazo sub eksperimentaj EPR-kondiĉoj (84 ± 2%, 79 ± 7%, kaj 47 ± 4% por αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, kaj αS/pLK, respektive - vidu Suplementan). Fig. 2e de datuma analizo c), oni povas vidi, ke la plilarĝigo detektita per la EPR-metodo ĉefe reflektas la interagadon de la C-fina regiono de αS kun diversaj polikatjonoj en la kondensita fazo (la ĉefa ŝanĝo kiam oni uzas TEMPOL-122-). αS), kaj ne proteinkondensado.Pliiĝo en mikroviskozeco estas observita en la sondilo.Kiel atendite, la EPR-spektro de la proteino sub kondiĉoj krom LLPS estis tute restarigita kiam 1 M NaCl estis aldonita al la miksaĵo (Suplementa Fig. 4b).Ĝenerale, niaj datumoj sugestas, ke la ŝanĝoj detektitaj de CW-EPR ĉefe reflektas la interagadon de la C-fina regiono de αS kun diversaj polikatjonoj en la densigita fazo, kaj ĉi tiu interago ŝajnas esti pli forta kun pLK ol kun Tau.
Por akiri pli da strukturaj informoj pri la proteinoj en la koacervato, ni decidis studi la LLPS-sistemon uzante NMR en solvaĵo.Tamen, ni povus nur detekti la αS-frakcion restantan en la disigita fazo, kio povas ŝuldiĝi al reduktita proteindinamiko ene de la koacervato kaj densa fazo ĉe la fundo de la solvo en NMR-analizo.Kiam ni analizis la strukturon kaj dinamikon de la proteino restanta en la disigita fazo de la LLPS-provaĵo uzante NMR (Suplementa Fig. 5c, d), ni rimarkis, ke la proteino kondutis preskaŭ idente en la ĉeesto de pLK kaj ΔNt-Tau, ambaŭ de kiuj estis en sekundara strukturo kaj dinamiko de la proteina spino, rivelitaj per eksperimentoj pri sekundara kemia ŝanĝo kaj R1ρ malstreĉiĝo.NMR-datenoj montras ke la C-finstacio de αS suferspertas signifan perdon de konformiga fleksebleco retenante sian malordan naturon, kiel la resto de la proteinsekvenco, pro siaj interagoj kun polikatjonoj.
Ĉar la plilarĝigo de CW-EPR-signalo observita en la kondensita fazo TEMPOL-122-αS reflektas la interagadon de la proteino kun polikatjonoj, ni faris EPR-titradon por taksi la ligan afinecon de αS al diversaj polikatjonoj en foresto de LLPS (neniu amasiĝo de polikatjonoj). Buffer LLPS), sugestante, ke la interagoj estas la samaj en diluitaj kaj koncentritaj fazoj (kiu estas konfirmita de niaj datumoj, Suplementa Fig. 4a kaj Suplementa Fig. 6).La celo estis vidi ĉu ĉiuj koacervatoj, malgraŭ siaj komunaj fluid-similaj trajtoj, elmontras ajnan subestas diferencigan konduton sur la molekula nivelo.Kiel atendite, la EPR-spektro plilarĝiĝis kun kreskanta polycation-koncentriĝo, reflektante malpliiĝon de molekula fleksebleco pro molekulaj interagoj de ĉiuj interagaj partneroj preskaŭ ĝis saturiĝo (Fig. 3e, Suplementa Fig. 6).pLK atingis ĉi tiun saturiĝon ĉe pli malalta molara proporcio (polication:αS) kompare kun ΔNt-Tau kaj Tau441.Fakte, komparo de la datenoj kun proksimuma ligomodelo supozanta n identajn kaj sendependajn ligejojn montris ke la ŝajna disociiĝokonstanto de pLK (~5 μM) estas grandordo pli malalta ol tiu de Tau441 aŭ ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Kvankam tio estas malglata takso, tio indikas ke αS havas pli altan afinecon por pli simplaj polikatjonoj kun kontinuaj pozitivaj ŝargregionoj.Konsiderante ĉi tiun diferencon en afineco inter αS kaj diversaj polikatjonoj, ni hipotezis, ke iliaj likvaj trajtoj povas ŝanĝiĝi alimaniere laŭlonge de la tempo kaj tiel suferi de malsamaj LSPT-procezoj.
Konsiderante la tre homplenan medion ene de la proteina koacervato kaj la amiloida naturo de la proteino, ni observis la konduton de la koacervato laŭlonge de la tempo por detekti eblajn LSPT-procezojn.Uzante BF kaj CF-mikroskopion (Figuro 4), ni observis, ke αS/Tau441 koacervas en granda mezuro en solvaĵo, formante grandajn gutetojn, kiuj kontaktas kaj malsekigas la surfacon ĉe la fundo de la puto/glito kiel plenaj gutetoj, kiel atendite (Aldona Figo). .7d);ni nomas ĉi tiujn fundformitajn strukturojn "proteinflosoj".Ĉi tiuj strukturoj restis fluidaj ĉar ili retenis la kapablon kunfandi (Suplementa Fig. 7b) kaj povus esti viditaj dum pluraj horoj post kiam LLPS estis ekigita (Fig. 4 kaj Suplementa Fig. 7c).Ni observis, ke la malsekiga procezo estas favorata sur la surfaco de hidrofilaj prefere ol hidrofobaj materialoj (Suplementa Fig. 7a), kiel atendite por elektrostataj koacervatoj kun malekvilibraj ŝargoj kaj tiel altaj elektrostataj surfacaj potencialoj.Precipe, αS/ΔNt-Tau-kuniĝo kaj rafting estis signife reduktitaj, dum αS/pLK-kondensaĵoj estis signife reduktitaj (Fig. 4).Dum la mallonga kovada tempo, la αS/pLK-gutetoj povis kunflui kaj malsekigi la hidrofilan surfacon, sed tiu procezo rapide ĉesis kaj post 5 horoj da kovado, nur limigitaj kunfluaj eventoj kaj neniu malsekiĝo estis observitaj.– ĝelo-guta transiro.
Reprezenta BF (grizskalaj paneloj) kaj CF (dekstraj paneloj, AF488-etikedita αS en verda) de koacervatprovaĵoj enhavantaj 100 µM αS (1% fluoreska etikedo) en LLPS-bufro en la ĉeesto de 100 µM Tau441 (supra) fluoreskeco) mikroskopaj bildoj ΔN. -Tau (meze) aŭ 1 mM pLK (malsupro) je malsamaj kovadotempoj kaj fokusaj altecoj (z, distanco de la fundo de la plato bone).La eksperimentoj estis ripetitaj 4-6 fojojn sendepende unu de la alia kun la samaj rezultoj.αS/Tau441 koacervatoj estas malsekigitaj post 24 horoj, formante flosojn pli grandajn ol la bildo.La skalbreto por ĉiuj bildoj estas 20 µm.
Ni tiam demandis ĉu la grandaj fluid-similaj proteinaj naĝejoj formitaj en αS/Tau441 LLPS kondukus al amiloida agregado de iu el la studitaj proteinoj.Ni sekvis la maturiĝon de αS / Tau441-gutetoj laŭlonge de la tempo kun WF-mikroskopio sub la samaj kondiĉoj kiel supre, sed uzante 1 μM AF488-etikeditan αS kaj Atto647N-etikeditan Tau441 (Fig. 5a).Kiel atendite, ni observis kompletan proteinan lokalizon dum la maturiĝoprocezo.Interese, de ĉ.Post 5 horoj, pli intensaj ne-cirklaj strukturoj estis observitaj ene de la flosoj, kiujn ni nomis "punktoj", kelkaj el kiuj estis kolokalizataj kun αS, kaj kelkaj estis riĉigitaj en Tau441 (Fig. 5a, blankaj sagoj).Tiuj punktoj ĉiam estis observitaj ene de flosoj laŭ pli granda mezuro por αS/ΔNt-Tau ol por αS/ΔNt-Tau.Ekzistis neniuj apartaj punktoj en la gutetoj de pLK kaj Tau-sistemoj nekompetentaj por fuzio/malsekigado.Por provi ĉu ĉi tiuj makuloj enhavantaj αS kaj Tau441 estas amiloid-similaj agregaĵoj, ni faris similan eksperimenton uzante CF-mikroskopion, en kiu Tau441 estis etikedita kun Atto647N kaj 12.5 μM amiloid-specifa tioflavino-T (ThT) estis aldonita de la komenco.tinkturfarbo.Kvankam ThT-makulado de αS/Tau441 gutetoj aŭ flosoj ne estis observita eĉ post 24 h da kovado (Fig. 5b, supra vico - ceteraj gutetoj super proteinaj flosoj), ThT-pozitivaj strukturoj enhavantaj Atto647N-Tau441 ene de la flosoj estis tre malfortaj.tio reproduktas la grandecon, formon kaj lokon de la antaŭe priskribitaj punktoj (Fig. 5b, mezaj kaj malsupraj vicoj), sugestante ke la makuloj povas respondi al amiloid-similaj agregaĵoj formitaj en maljuniĝantaj fluidaj koacervatoj.
WF 25 μM αS en diversaj kovadotempoj kaj fokusaj altecoj (z, distanco de nebindita fundo) en la ĉeesto de 25 μM Tau441 (1 μM AF488-etikedita αS kaj Atto647N-etikedita Tau441) en puto de mikroskopplato kun LLPS-bufro) .Ses eksperimentoj estis sendepende ripetitaj kun similaj rezultoj.b CF-mikroskopa bildo de 25 μM αS en ĉeesto de 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-etikedita Tau441) kaj 12.5 μM tioflavino-T (ThT).Pezbalancitaj proteingutetoj kaj deponitaj proteinflosoj kaj punktoj estas montritaj en la supraj kaj mezaj vicoj, respektive.La malsupra vico montras bildojn de flosoj kaj gutoj de 3 sendependaj kopioj.Blankaj sagoj indikas ThT-pozitivajn punktojn en ambaŭ paneloj.La skalbreto por ĉiuj bildoj estas 20 µm.
Por ekzameni pli detale la ŝanĝojn en la koacervata proteinreto dum la transiro de likvaĵo al solido, ni uzis fluoreskecan dumvivan bildigon (FLIM) kaj Förster-resonancan energitransigo-mikroskopion (FRET) (Figuro 6 kaj Suplementaj Figuroj 8 kaj 9).Ni hipotezis, ke la koacervata maturiĝo de la tavolo en pli densigitan aŭ eĉ solid-similan agregitan proteinstrukturon kondukas al pli proksima kontakto inter la proteino kaj la fluoreska sondilo alkroĉita al ĝi, eble produktante estingan efikon manifestitan en mallongigita sonda vivdaŭro (τ) , kiel priskribite antaŭe40.,41 ,42.Krome, por duoble etikeditaj provaĵoj (AF488 kaj Atto647N kiel FRET-donacanto kaj akceptanto tinkturfarboj, respektive), tiu malkresko en τ ankaŭ povas esti akompanita per koacervatkondensado kaj pliiĝo en FRET (E) efikeco dum LSPT.Ni monitoris floson kaj makulformadon laŭlonge de la tempo en specimenoj de LLPS αS/Tau441 kaj αS/ΔNt-Tau (25 µM de ĉiu proteino en LLPS-bufro enhavanta 1 µM AF488 etikedita αS kaj/aŭ Atto647N etikedita Tau441 aŭ ΔNt-Tau).Ni observis ĝeneralan tendencon, ke la fluoreskeca vivdaŭro de la sondiloj AF488 (τ488) kaj Atto647N (τ647N) iomete malpliiĝis dum la koacervatoj maturiĝis (Fig. 6 kaj Suplementa Fig. 8c).Kurioze, ĉi tiu ŝanĝo estis signife plibonigita por punktoj ene de flosoj (Fig. 6c), indikante ke plia proteinkondensado okazis ĉe punktoj.Apoge al tio, neniu signifa ŝanĝo en fluoreskeca vivdaŭro estis observita por αS/ΔNt-Tau gutetoj aĝaj dum 24 h (Suplementa Fig. 8d), sugestante, ke guteto-geliĝo estas procezo malsama de makulado kaj tio ne estas akompanata de signifa molekula reorganizo. ene de koacervatoj.Oni devas rimarki, ke la punktoj havas malsamajn grandecojn kaj varian enhavon en αS, precipe por la sistemo αS/Tau441 (Suplementa Fig. 8e).La malkresko en spotfluoreskeca vivdaŭro estis akompanita de pliiĝo en intenseco, precipe por Atto647N etikedita Tau441 (Suplementa Fig. 8a), kaj pli altaj FRET-efikecoj por kaj αS/Tau441 kaj αS/ΔNt-Tau-sistemoj, indikante plian kondensadon en LLPS Kvin horoj. post ekigado, la proteinoj ene de la statika elektro kondensiĝis.Kompare kun αS/ΔNt-Tau, ni observis pli malaltajn τ647N kaj iom pli altajn τ488-valorojn en αS/Tau441-punktoj, akompanataj de pli malaltaj kaj pli malhomogenaj FRET-valoroj.Eble, ĉi tio povas esti rilatita al la fakto, ke en la αS/Tau441-sistemo, la observita kaj atendata αS-abundo en agregaĵoj estas pli heterogena, ofte substoiĥiometria kompare kun Tau, ĉar Tau441 mem ankaŭ povas sperti LLPS kaj agregadon (Kuldona Fig. 8e) .Tamen, la grado da gutetokunfluo, flosformacio, kaj, grave, proteinagregado ene de likvaĵ-similaj koacervatoj estas maksimuma kiam kaj Tau441 kaj αS ĉeestas.
a Dumviva fluoreskeca mikroskopio (FLIM) bildoj de αS/Tau441 kaj αS/ΔNt-Tau ĉe 25 μM de ĉiu proteino (1 μM AF488-etikedita αS kaj 1 μM Atto647N-etikedita Tau441 aŭ ΔNt-Tau-bufro) en .La kolonoj montras reprezentajn bildojn de LLPS-provaĵoj en malsamaj maturiĝotempoj (30 min, 5 h kaj 24 h).La ruĝa kadro montras la regionon enhavantan αS/Tau441-punktojn.Vivtempoj estas montritaj kiel koloraj stangoj.Skalbreto = 20 µm por ĉiuj bildoj.b Zoomita FLIM-bildo de la elektita areo, montrita en la ruĝa skatolo en panelo a.Vivintervaloj estas montritaj uzante la saman kolorskalon kiel en panelo a.Skalstango = 5 µm.c Histogramoj montrantaj AF488 (alkroĉita al αS) aŭ Atto647N (alkroĉita al Tau) por malsamaj proteinspecioj (gutetoj-D-, floso-R- kaj makuleto-P) identigitaj en FLIM-bildoj registritaj por αS-) tempaj distribuoj vivdaŭro de Tau441 kaj αS/ΔNt-Tau koacervataj specimenoj (N = 17-32 ROI por D, 29-44 ROI por R, kaj 21-51 ROI por punktoj).Mezumaj kaj mezaj valoroj estas montritaj kiel flavaj kvadratoj kaj nigraj linioj ene de skatoloj, respektive.La malsuperaj kaj supraj limoj de la skatolo reprezentas la unuan kaj trian kvartilojn, respektive, kaj la minimumaj kaj maksimumaj valoroj ene de la 1,5-obla interkvartila gamo (IQR) estas montritaj kiel barbo.Outliers estas montritaj kiel nigraj diamantoj.Statistika signifo inter paroj de distribuoj estis determinita uzante du-provan t-teston, supozante neegalajn variadojn.Duvostaj t-testaj p-valoroj estas montritaj per asteriskoj por ĉiu paro de komparitaj datumoj (* p-valoro> 0.01, ** p-valoro> 0.001, *** p-valoro> 0.0001, **** p-valoro > 0,00001), ns Indikas neglekteblecon (p-valoro > 0,05).La precizaj p-valoroj estas donitaj en Suplementa Tabelo 1, kaj la originaj datumoj estas prezentitaj kiel krudaj datumaj dosieroj.
Por plue pruvi la amiloid-similan naturon de makuloj/agregaĵoj, ni traktis nemakulajn koacervatajn specimenojn dum 24 horoj kun altaj koncentriĝoj de (1 M) NaCl, kio rezultigis la apartigon de agregaĵoj de proteinaj koacervatoj.Kiam izolitaj agregaĵoj (t.e., disigita solvo de agregaĵoj) estis observitaj uzante atomfortan mikroskopion (AFM), ni observis ĉefe sferan morfologion kun regula alteco de ĉirkaŭ 15 nm, kiu tendencas asocii en kondiĉoj de alta sala koncentriĝo, simila al la konduto de tipaj amiloidaj fibriloj pro la forta hidrofoba efiko sur la surfaco (rimarku, ke fibriloj tipe havas altecon de ~10 nm) (Suplementa Fig. 10a).Kurioze, kiam izolitaj agregaĵoj estis kovataj kun ThT en norma fluoreskeca provo de ThT, ni observis rimarkindan pliiĝon en ThT-fluoreskeca kvantuma rendimento, komparebla al tio observita kiam la tinkturfarbo estis kovita kun tipaj αS-amiloidaj fibriloj (Suplementa Fig. 10b), sugestante tion. la koacervataj agregaĵoj enhavas amiloid-similajn strukturojn..Fakte, la agregaĵoj estis toleremaj al altaj salaj koncentriĝoj sed sentemaj al 4 M-guanidina klorido (GdnHCl), kiel tipaj amiloidaj fibriloj (Kuldona Fig. 10c).
Poste, ni analizis la konsiston de la agregaĵoj uzante ununuran molekulan fluoreskecon, specifan fluoreskecan korelacion / kruc-korelacian spektroskopion (FCS/FCCS), kaj eksplodan analizon de dukolora koincida detekto (TCCD).Tiucele ni izolis agregaĵojn formitajn post 24 horoj da kovado en 100 μl LLPS-provaĵoj enhavantaj αS kaj Tau441 (ambaŭ 25 μM) kune kun 1 μM AF488-etikedita αS kaj 1 μM Atto647N-etikedita Tau441.Diluu la rezultan disigitan entuta solvon al monomolekula stato uzante la saman PEG-liberan bufron kaj 1 M NaCl (la sama bufro uzata por apartigi agregaĵojn de koacervato) por malhelpi ajnajn eblajn elektrostatikajn interagojn inter LLPS kaj proteino.Ekzemplo de la tempa trajektorio de ununura molekulo povas esti vidita en Fig. 7a.FCCS/FCS-analizo (kruc-korelacio, CC kaj aŭtokorelacio, AC) montris, ke agregaĵoj enhavantaj αS kaj tau estis abundaj en la provaĵoj (vidu CC-kurbon en Fig. 7b, maldekstra panelo), kaj troo de resta monomera proteino ekestis kiel rezulto de la dilua procezo (vidu AC-kurbojn en Figuro 7b, maldekstra panelo).Kontrolaj eksperimentoj faritaj sub la samaj solvkondiĉoj uzante specimenojn enhavantajn nur monomerajn proteinojn montris neniujn CC-kurbojn, kaj la AC-kurboj kongruas bone kun la unu-komponenta difuzmodelo (Ek. 4), kie monomeraj proteinoj havas la atendatajn difuzkoeficientojn (Fig. 7b). ), dekstra panelo).La difuzkoeficiento de agregitaj partikloj estas malpli ol 1 µm2/s, kaj tiu de monomeraj proteinoj estas proksimume 1 µm2/s.50–100 µm/s;valoroj estas similaj al antaŭe publikigitaj valoroj por sonikataj αS-amiloidaj fibriloj kaj monomera αS aparte sub similaj solvkondiĉoj44.Kiam ni analizis la agregaĵojn per TCCD-eksploda analizo (Fig. 7c, supra panelo), ni trovis, ke en ĉiu izolita agregaĵo (αS/Tau heteroagregate), ĉirkaŭ 60% de la detektitaj agregaĵoj enhavis kaj αS kaj tau, ĉirkaŭ 30% enhavis nur. tau, proksimume 10% αS nur.Stoiĥiometria analizo de αS/Tau-heteroagregatoj montris, ke la plej multaj el la heteroagregaĵoj estis riĉigitaj je tau (stojiometrio sub 0,5, la meza nombro da tau-molekuloj per agregaĵo estas 4 fojojn pli ol αS-molekuloj), kio kongruas kun nia laboro observita en FLIM surloke. eksperimentoj..FRET-analizo montris, ke ĉi tiuj agregaĵoj enhavis ambaŭ proteinojn, kvankam la realaj FRET-valoroj en ĉi tiu kazo ne estas tre gravaj, ĉar la distribuado de fluoroforoj en ĉiu agregaĵo estis hazarda pro troo de neetikedita proteino uzata en la eksperimento.Kurioze, kiam ni faris la saman analizon uzante la 45,46 maturan amiloidan agreg-mankan varianton Tau (vidu Suplementan Fig. 11a, b), ni rimarkis, ke kvankam la αS elektrostatika agregado estis la sama (Suplementa Fig. 11c, d), la kapablo formi agregaĵojn ene de la koacervato estis draste reduktita kaj FLIM detektis plurajn punktojn surloke eksperimentojn, kaj malfortaj kruc-korelaciaj kurboj estis observitaj por izolitaj entutaj provaĵoj.Tamen, por malgranda nombro da detektitaj agregaĵoj (nur unu dekono de Tau441), ni observis ke ĉiu agregaĵo estis riĉigita en αS ol tiu Tau-variaĵo, kun proksimume 50% de la detektitaj agregaĵoj enhavantaj nur αS-molekulojn, kaj αS estis heterogena en troo. .agregaĵoj (vidu Suplementan Fig. 11e), kontraste al la heterogenaj agregaĵoj generitaj de Tau441 (Fig. 6f).La rezultoj de tiuj eksperimentoj montris ke kvankam αS mem estas kapabla je akumulado kun tau ene de la koacervato, tau-nukleado estas pli favora sub tiuj kondiĉoj, kaj la rezultaj amiloid-similaj agregaĵoj povas funkcii kiel formo de αS kaj tau.Tamen, post kiam tau-riĉa kerno estas formita, heterotipaj interagoj inter αS kaj tau estas preferitaj en agregaĵoj super homotipaj interagoj inter taŭ-molekuloj;ni ankaŭ observas proteinajn retojn en likvaj αS/tau koacervatoj.
a Reprezentaj fluoreskecaj tempspuroj de ununuraj molekuloj de izolitaj agregaĵoj formitaj en elektrostatikaj koacervatoj αS/Tau441.Eksplodoj respondaj al αS/Tau441-agregatoj (eksplodoj super la indikita sojlo) estis observitaj en tri detektaj kanaloj (AF488 kaj Atto647N-emisio post rekta ekscito, bluaj kaj ruĝaj linioj, Atto647N-emisio post nerekta ekscito), FRET, viola linio).b FCS/FCCS-analizo de specimeno de izolitaj αS/Tau441-agregaĵoj akiritaj de LLPS (maldekstra panelo).Aŭtokorelaciaj (AC) kurboj por AF488 kaj Atto647N estas montritaj en blua kaj ruĝa, respektive, kaj kruc-korelaciaj (CC) kurboj asociitaj kun agregaĵoj enhavantaj ambaŭ tinkturfarbojn estas montritaj en purpuro.La AC-kurboj reflektas la ĉeeston de etikeditaj monomeraj kaj agregitaj proteinspecioj, dum la CC-kurboj montras nur la difuzon de duoble-etikeditaj agregaĵoj.La sama analizo, sed sub la samaj solvkondiĉoj kiel en izolitaj lokoj, specimenoj enhavantaj nur monomeran αS kaj Tau441 estas montritaj kiel kontroloj en la dekstra panelo.c Fluoreskeca fulma analizo de ununuraj molekuloj de izolitaj agregaĵoj formitaj en elektrostatikaj koacervatoj αS/Tau441.Informoj por ĉiu agregaĵo trovita en kvar malsamaj ripetoj (N = 152) estas intrigitaj kontraŭ ilia stoiĥiometrio, S-valoroj, kaj FRET-efikeco (supra panelo, kolordrinkejo reflektas okazon).Tri specoj de agregaĵoj povas esti distingitaj: -αS-nur agregaĵoj kun S~1 kaj FRET~0, Tau-nur agregaĵoj kun S~0 kaj FRET~1, kaj heterogenaj Tau/αS agregaĵoj kun meza S kaj FRET Taksoj de la kvanto de ambaŭ markilaj proteinoj detektitaj en ĉiu heterogena agregaĵo (N = 100) estas montritaj en la malsupra panelo (la kolorskalo reflektas la okazon).Krudaj datumoj estas provizitaj en formo de krudaj datumoj dosieroj.
La maturiĝo aŭ maljuniĝo de likvaj proteinkondensaĵoj en ĝel-similajn aŭ solidajn strukturojn laŭlonge de la tempo estis raportitaj esti implikitaj en pluraj fiziologiaj funkcioj de la kondensaĵo47 same kiel en malsano, kiel nenormala procezo antaŭanta amiloidan agregadon 7, 48, 49. Ĉi tie. ni detale studas fazan apartigon kaj konduton.LSPT αS en la ĉeesto de hazardaj polikatjonoj en kontrolita medio ĉe malaltaj mikromolaraj koncentriĝoj kaj fiziologie signifaj kondiĉoj (notu ke la kalkulita fiziologia koncentriĝo de αS estas >1 µM50), sekvante tipan termodinamike movitan konduton de LPS.Ni trovis, ke αS, kiu enhavas tre negative ŝargitan C-finan regionon ĉe fiziologia pH, kapablas formi proteinriĉajn gutetojn en akva solvaĵo per LLPS en ĉeesto de tre katjonaj malordaj peptidoj kiel pLK aŭ Tau per la procezo de elektrostatika. kompleksa kondensado en la ĉeesto de agregaj makromolekuloj.Ĉi tiu procezo povas havi gravajn efikojn en la ĉela medio kie αS renkontas diversajn polikatjonajn molekulojn asociitajn kun sia malsan-rilata agregado kaj en vitro kaj en vivo51,52,53,54.
En multaj studoj, proteindinamiko ene de gutetoj estis konsiderita unu el la ŝlosilaj faktoroj determinantaj la maturiĝoprocezon55,56.En elektrostataj αS koacervas kun polikatjonoj, la maturiĝoprocezo ŝajne dependas de la forto de interagoj kun polikatjonoj, la valento, kaj la multeco de tiuj interagoj.Ekvilibroteorio indikas ke ekvilibra pejzaĝo de du likvaj statoj estus la ĉeesto de granda guteto riĉa je biopolimeroj kiuj movas LLPS57,58.Gutetokresko povas esti atingita per Ostwald-maturiĝo59, kunfluo60 aŭ konsumo de libera monomero en la disigita fazo61.Por αS kaj Tau441, ΔNt-Tau aŭ pLK, la plej granda parto de la proteino estis koncentrita en la kondensaĵo sub la kondiĉoj uzitaj en ĉi tiu studo.Tamen, dum plenmezuraj taŭaj gutetoj kunfluis rapide sur surfaca malsekiĝo, gutetokunfluo kaj malsekigado estis malfacilaj por ΔNt-Tau kaj pLK, sugestante rapidan perdon de likvaj trajtoj en tiuj du sistemoj.Laŭ nia FLIM-FRET-analizo, la aĝaj pLK kaj ΔNt-Tau-gutetoj montris similan gradon da proteinagregado (simila fluoreskeca vivdaŭro) kiel la originaj gutetoj, sugestante, ke la origina proteinreto estis retenita, kvankam pli rigida.
Ni raciigas niajn eksperimentajn rezultojn en la sekva modelo (Figuro 8).La komence provizore formitaj gutetoj ofte estas proteinretoj sen elektrostatika kompenso, kaj tiel ekzistas areoj de ŝargmalekvilibro, precipe ĉe la gutetinterfaco, rezultigante gutetojn kun alta elektrostatika surfacpotencialo.Por kompensi por pagendaĵo (fenomeno ofte referita kiel valentmalplenigo) kaj minimumigi la surfacpotencialon de la gutetoj, la gutetoj povas inkludi novajn polipeptidojn de la diluita fazo, reorganizi proteinretojn por optimumigi ŝargajn interagojn, kaj interagi kun aliaj gutetoj.kun surfacoj (malsekigado).La αS/pLK gutetoj, pro sia pli simpla proteinreto (nur heterotipaj interagoj inter αS kaj pLK) kaj pli granda afineco por protein-proteinaj interagoj, ŝajnas povi ekvilibrigi la pagendaĵon de la kondensaĵo pli rapide;efektive, ni observis pli rapidan proteinkinetikon en komence formitaj αS/pLK koacervatoj ol en αS/Tau.Post valentmalplenigo, la interagoj iĝas malpli efemeraj kaj la gutetoj perdas siajn likvajn trajtojn kaj iĝas ĝelsimilaj, ne-flamemaj gutetoj kun malalta elektrostatika surfacpotencialo (kaj tial nekapablaj malsekigi la surfacon).En kontrasto, αS/Tau-gutetoj estas malpli efikaj ĉe optimumigado de guteta pagendaĵo-ekvilibro pro pli kompleksaj proteinretoj (kun kaj homotipaj kaj heterotipaj interagoj) kaj la pli malforta naturo de proteininteragoj.Tio rezultigas gutetojn kiuj retenas likvan konduton por plilongigitaj tempodaŭroj kaj elmontras altan elektrostatikan surfacpotencialon kiu tendencas esti minimumigita per kunfluado kaj kreskado (tiel minimumigante la surfacareon/volumenoproporcion de la gutetoj) kaj malsekigante la hidrofilan surfackemion.Tio kreas grandajn densajn proteinbibliotekojn kiuj retenas fluidajn trajtojn ĉar la interagoj restas tre pasemaj pro la konstanta serĉo por ŝargooptimumigo en la proteinreto.Interese, N-finhavaj formoj de Taŭo, inkluzive de kelkaj nature okazantaj izoformoj62, elmontras mezan konduton, kun kelkaj koacervatoj maljuniĝantaj kun αS en longvivajn ĝel-similajn gutetojn, dum aliaj transformas en grandajn likvajn kondensaĵojn.Tiu dueco en la maturiĝo de αS elektrostatikaj koacervatoj estas kongrua kun lastatempaj LLPS-teoriaj kaj eksperimentaj studoj kiuj identigis korelacion inter valentmalplenigo kaj elektrostatika kribrido en kondensaĵoj kiel ŝlosilo por kontrolado de kondensaĵgrandeco kaj fluidaj trajtoj.Mekanismo 58.61.
Tiu skemo montras la supozeblan amiloidan agregpadon por αS kaj Tau441 per LLPS kaj LSPT.Kun pliaj anjon-riĉaj (ruĝaj) kaj katjonriĉaj (bluaj) regionoj, αS kaj tau elektrostatikaj koacervatoj kun kontentiga valento havas pli malaltan surfacenergion kaj tial malpli kunfluon, rezultigante rapidan gutetmaljuniĝon.Stabila ne-aglomera ĝelstato estas atingita..Tiu situacio estas tre favora koncerne la αS/pLK-sistemon pro sia pli alta afineco kaj pli simpla protein-para interaga reto, kiu enkalkulas rapidan ĝel-similan transiron.Male, gutetoj kun nekontentiga valento kaj, tial, protein-ŝarĝitaj regionoj disponeblaj por interagado, faciligas al la koacervato kunfandi kaj malsekigi la hidrofilan surfacon por redukti ĝian altan surfacan energion.Tiu situacio estas preferinda por αS/Tau441 koacervatoj, kiuj havas multvalentan kompleksan reton konsistantan el malfortaj Tau-Tau kaj αS-Tau-interagoj.En victurno, pli grandaj koacervatoj pli facile retenos siajn fluid-similajn trajtojn, permesante al aliaj protein-al-proteinaj interagoj okazi.Poste, amiloidaj heterogenaj agregaĵoj enhavantaj kaj αS kaj tau formiĝas ene de la koacervatlikvaĵo, kiu povas esti rilatita al tiuj trovitaj en inkluzivaj korpoj, kiuj estas markostampoj de neŭrodegeneraj malsanoj.
La grandaj fluid-similaj strukturoj formiĝis dum maturiĝo de αS/Tau441 kun tre ŝtopita sed dinamika proteinmedio kaj, laŭ pli malgranda mezuro, αS/ΔNt-Tau-koacervatoj estas idealaj rezervujoj por la nukleado de proteinagregacio.Ni ja observis la formadon de solidaj proteinagregaĵoj en ĉi tiu speco de proteinaj koacervatoj, ofte enhavantaj kaj αS kaj tau.Ni montris, ke ĉi tiuj heteroagregaĵoj estas stabiligitaj per ne-elektrostataj interagoj, kapablas ligi amiloid-specifajn ThT-farbojn sammaniere kiel tipaj amiloidaj fibriloj, kaj ja havas similan reziston al diversaj influoj.La αS/tau-agregaĵoj formitaj per LLPS pruviĝis havi amiloid-similajn trajtojn.Efektive, la matura variaĵo de Tau mankanta en amiloida agregado estas signife difektita en la formado de tiuj heterogenaj αS-agregaĵoj ene de la likva elektrostatika koacervado.La formado de αS/Tau441-agregaĵoj estis observita nur ene de la koacervatoj, kiuj retenis likvaĵ-similajn trajtojn, kaj neniam, se la koacervatoj/gutetoj ne atingis la ĝelstaton.En ĉi-lasta kazo, la pliigita forto de elektrostatikaj interagoj kaj, kiel rezulto, la rigideco de la proteinreto malhelpas la necesajn konformigajn rearanĝojn de proteinoj por establi novajn proteininteragojn necesajn por amiloida nukleado.Tamen, tio povas esti atingita en pli flekseblaj, likv-similaj koacervatoj, kiuj en victurno estas pli verŝajnaj resti likvaj kiam ili pliiĝas en grandeco.
La fakto ke la formado de agregaĵoj ene de la densigita fazo estas preferinda en grandaj αS/Tau-kondensaĵoj ol en malgrandaj gutetoj kiuj rapide ĝeliĝas, elstarigas la signifon de identigado de la faktoroj kiuj kontrolas gutetkunfluon.Tiel, ne nur ekzistas tendenco por faza apartigo, sed la grandeco de la kondensaĵo devas esti kontrolita por taŭga funkciado same kiel prevento de malsano58,61.Niaj rezultoj ankaŭ emfazas la gravecon de la ekvilibro inter LLPS kaj LSPT por la αS/Tau-sistemo.Dum gutetformacio povas protekti kontraŭ amiloida agregado reduktante la kvanton de proteinmonomeroj haveblaj sub saturiĝkondiĉoj, kiel estis proponita en aliaj sistemoj63,64, gutetofuzio ĉe altaj gutetniveloj povas konduki al interna proteinagregado tra malrapidaj konformigaj rearanĝoj.proteinretoj..
Ĝenerale, niaj datumoj forte emfazas la gravecon de kohezia valento kaj kontentaj/nekontentaj interagoj en gutaj retoj en la kunteksto de LSPT.Aparte, ni montras, ke plenlongaj αS/Tau441-kondensaĵoj kapablas efike kunfandiĝi kaj nuklei por formi amiloid-similajn heteroagregatojn, kiuj inkluzivas ambaŭ proteinojn kaj proponas molekulan mekanismon bazitan sur niaj eksperimentaj rezultoj.La kunagregado de du proteinoj en la αS/Tau-flua koacervado, kiun ni raportas ĉi tie, ja povas esti rilatita al la samlokigo de du proteinoj en inkludoj, kiuj estas markostampoj de la malsano, kaj povas kontribui al kompreno de la rilato inter LLPS kaj amiloida agregado, pavimante laŭ la manieron por tre ŝarĝita IDP en neŭrodegenero.
Monomeraj WT-αS, cisteinaj mutaciuloj (Q24C-αS, N122C-αS) kaj ΔCt-αS-variaĵoj (Δ101-140) estis esprimitaj en E. coli kaj purigitaj kiel antaŭe priskribite.5 mM DTT estis inkluzivita en ĉiuj paŝoj en la purigado de αS-cisteinaj mutaciuloj por malhelpi disulfidajn ligojn.Tau441 izoformo (plasmido akirita de Addgene #16316), ΔNt-Tau-variaĵo (Δ1–150, akirita per klonado de IVA kun enkondukoj CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) kaj AggDef-Tau-variaĵo estis purigita-kulturo (Δ1127-a-tau-variaĵo) (ΔGCCACACCGCGG). kreskis al OD600 = 0.6-0.7 je 37 °C kaj 180 rpm, kaj esprimo estis induktita per IPTG dum 3 horoj je 37 °C.Rikoltu ĉelojn je 11,500 xg dum 15 min je 4 °C kaj lavu per sala bufro enhavanta 150 mM NaCl.Resuspendu la buleton en liza bufro (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidino 50 μM, copeptin μM100).La sonication paŝo estis farita sur glacio kun amplitudo de 80% por 10 pulsoj (1 min sur, 1 min malŝaltita).Ne superu 60 ml en unu ultrasono.E. coli-lysates estis varmigitaj je 95 ° C dum 20 minutoj, tiam malvarmetigitaj sur glacio kaj centrifugitaj je 127,000 × g dum 40 minutoj.La klarigita supernatanto estis aplikita al 3.5 kDa membrano (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) kaj dializita kontraŭ 4 L da dializa bufro (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM. , PMSF 0.1 mM) dum 10 horoj.Kolumno de interŝanĝo de 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, Usono) estis ekvilibrigita kun ekvilibriga bufro (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).La taulysate estis filtrita tra 0.22 μm PVDF-filtrilo kaj injektita en la kolonon kun flukvanto de 1 ml/min.Elucio estis efektivigita iom post iom, tau estis eluita kun 15-30% elucia bufro (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Frakcioj estis analizitaj per SDS-PAGE, kaj ĉiuj frakcioj enhavantaj unu grupon kun la atendata molekula pezo de tau estis koncentritaj uzante 10 kDa centrifugilfiltrilon kaj anstataŭigitaj per bufro enhavanta 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM kaj DTT 2 mM por la fina proteinkoncentriĝo estis 100 μM.La proteinsolvo tiam estis trapasita tra 0.22 μm PVDF-filtrilo, rapide frostigita kaj stokita je -80 °C.Proteino K18 estis afable provizita de Prof. Alberto Boffi.La pureco de la preparado estis >95% kiel konfirmite de SDS-PAGE kaj MALDI-TOF/TOF.Diversaj cisteinoj estis kemie etikeditaj kun AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Usono) aŭ TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanado).estis konfirmitaj per absorbado kaj MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau kaj K18 estis etikeditaj kun indiĝenaj cisteinaj restaĵoj ĉe pozicioj 191 kaj 322 uzante Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germanio) sekvante la saman proceduron.Neta pagendaĵo per restaĵmapoj por αS kaj Tau441 estis generita uzante CIDER66.
Solida poli-L-lizino (pLK DP 90-110 laŭ NMR de provizanto, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabamo, Usono) estis solvita en 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 ĝis 10 mM koncentriĝo, procezo sonikita por 5 minutojn en ultrasona akvobano kaj konservu je -20 °C.PEG-8, dekstrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, Usono) kaj FITC-dextrano-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, Usono) estas akvosolvebla kaj vaste distribuita en LLPS-bufro.Dializo forigas poluajn salojn.Ili tiam estis filtritaj tra injektilfiltrilo kun pora grandeco de 0.22 μm, kaj iliaj koncentriĝoj estis kalkulitaj per refraktometro (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, Usono).LLPS-provaĵoj estis preparitaj ĉe ĉambra temperaturo en la sekva sinsekvo: bufro kaj eltrudado estis miksitaj kaj 1 mM tris(2-karboksietil)fosfino (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etano- 1, 2-diildinitrilo) tetraaceta acido (EDTA, karboksinto) kaj miksaĵo de 1% proteazo-inhibitoro (PMSF 100 mM, benzimido 1 mM, leupeptin 5 μM).Tiam αS kaj kunfanditaj polikatjonoj (opcioj pLK aŭ Tau) estas aldonitaj.Por tioflavin-T temposerioeksperimentoj (ThT, Carbosynth, Compton, UK), uzu la totalan ThT-koncentriĝon por esti duono de la αS-koncentriĝo.Milde sed plene miksu la specimenojn por certigi, ke ili estas homogenaj.La koncentriĝo de ĉiu komponanto variis de eksperimento al eksperimento, kiel priskribite en la sekcio Rezultoj.Azido estis uzita ĉe koncentriĝo de 0.02% (w/v) kiam ajn la daŭro de la eksperimento superis 4 horojn.Por ĉiuj analizoj uzantaj LLPS-specimenojn, lasu la miksaĵon ekvilibrigi dum 5 minutoj antaŭ analizo.Por malpeza disvastiganalizo, 150 µl da specimenoj estis ŝarĝitaj sur nedevigajn 96-putajn mikroplatojn (µClear®, nigra, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Aŭstrio) kaj kovritaj per glua filmo.LLP-oj estis monitoritaj per mezurado de absorbo je 350 nm en la centro de la solvo en CLARIOstar-platleganto (BMG Labtech, Ortenberg, Germanio).La eksperimentoj estis faritaj triope je 25 °C, kaj la eraroj estis kalkulitaj kiel la norma devio de la meznombro.La diluita fazo estis kvantigita per specimena centrifugado kaj SDS-PAGE-ĝela analizo, kaj la αS-frakcio en la diluitaj kaj koncentritaj fazoj estis kvantigita en diversaj LLPS-solvoj.100 μl LLPS-provaĵo enhavanta 1 μM AF488-etikeditan αS estis preparita per ĝisfunda miksado sekvita per centrifugado je 9600 × g dum 30 minutoj, post kiu la precipitaĵo estis kutime videbla.La supraj 50 μl de la supernatant estis uzata por proteinkvanto uzante SDS-PAGE-ĝelon.Ĝeloj estis skanitaj per AF488-filtriloj uzante ChemiDoc-ĝelan bildigan sistemon (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, Usono) aŭ makulitaj per Coomassie-makulo kaj bildigitaj per taŭgaj filtriloj.La rezultaj bandoj estis analizitaj per ImageJ-versio 1.53i (Nacia Institutoj de Sano, Usono).La eksperimentoj estis faritaj duplikate en du malsamaj eksperimentoj kun similaj rezultoj.
Tipe, 150 μl da specimenoj estis aplikitaj al ne-ligantaj 96-putaj mikroplatoj kaj bildigitaj ĉe ĉambra temperaturo sur inversa mikroskopo Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Germanio).Por punktoeksperimentoj, µ-Slide Angiogenesis-platoj (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germanio) aŭ 96-butaj polistirenmikroplatoj (Corning Costar Corp., Acton, Masaĉuseco) ankaŭ estis uzitaj.EL6000-halogenaj aŭ hidrargaj metalaj Halogenaj lampoj estis utiligitaj kiel lumfontoj (por BF/DIC kaj WF-bildigo, respektive).Por WF-mikroskopio, 40x pligrandiga aercelo (Leica Microsystems, Germanio) estis uzita por enfokusigi la lumon sur la provaĵo kaj kolekti ĝin.Por AF488 kaj ThT etikeditaj specimenoj, filtrila ekscito kaj emisio kun normaj GFP-filtriloj, ekscito- kaj emisio-bandpasaj filtriloj, respektive, 460-500 nm kaj 512-542 nm-bandpasaj filtriloj, kaj 495 nm dikroika spegulo.Por provaĵoj etikeditaj kun Atto647N, norma aro de Cy5-filtriloj kun ekscito kaj emisio-bandpasfiltriloj 628-40 nm kaj 692-40 nm, respektive, kaj 660 nm dikroika spegulo estis uzita.Por BF kaj DIC-mikroskopio, uzu la saman reflektitan lumkolektan celon.La kolektita lumo estis registrita sur Leica DFC7000 CCD-fotilo (Leica Microsystems, Germanio).La ekspontempo estis 50 ms por mikroskopiobildigo de BF kaj DIC kaj 20-100 ms por mikroskopiobildigo de WF.Por komparo, la malkovrotempo por ĉiuj eksperimentoj kun ThT estis 100 ms.Temppasaj eksperimentoj estis faritaj por bildigi gutetkunfluon, kie bildoj estas kolektitaj ĉiujn 100 ms dum pluraj minutoj.ImageJ (NIH, Usono) estis uzita por bildanalizo.La eksperimentoj estis faritaj triope kun similaj rezultoj.
Por kolokalizaj eksperimentoj, FRAP kaj 3D rekonstruo, bildoj estis akiritaj sur Zeiss LSM 880 inversa konfokusa mikroskopo uzante ZEN 2 bluan eldonon (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germanio).Provaĵoj de 50 µl estis aplikitaj al µ-Slide Angiogenesis Petri-pladoj (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Germanio), traktitaj kun hidrofila polimero (ibiTreat) kaj muntitaj en 63× ole-merga celo (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oleo) sur DIC).Bildoj estis akiritaj uzante 458 Nm, 488 Nm, kaj 633 Nm argonajn laserliniojn kun rezolucio de 0.26 µm/pikselo kaj ekspontempo de 8 µs/pikselo por ekscito kaj emisiodetektofenestroj de 470-600 Nm, 493-628 nm, kaj 638-755 nm estis uzataj por bildigi ThT, AF488 kaj Atto647N, respektive.Por la FRAP-eksperimentoj, tempo-rapida fotado de ĉiu provaĵo estis registrita je 1 kadro je sekundo.La eksperimentoj estis faritaj triope ĉe ĉambra temperaturo kun similaj rezultoj.Ĉiuj bildoj estis analizitaj per Zen 2 blua eldono programaro (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germanio).La FRAP-kurboj estis normaligitaj, punktitaj kaj adaptitaj al intenseco/tempaj datumoj ĉerpitaj de bildoj uzante Zen 2 uzante OriginPro 9.1.La reakiro-kurboj estis konvenitaj al mono-eksponenta modelo por respondeci pri molekula difuzo kun kroma eksponenta termino por respondeci pri la akira blankiga efiko.Ni tiam kalkulis D uzante la nominalan blankiga radiuso kaj la antaŭe determinita reakiro duoniĝotempo kiel en la ekvacio de Kang et al.5 35 montrata.
Unuopaj cisteinaj variantoj de αS estis sintezitaj kun 4-hidroksi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) ĉe pozicioj 24 (TEMPOL-24-αS) kaj 122 (TEMPOL-122-αS), respektive.Spin Labeling Por EPR-eksperimentoj, la αS-koncentriĝo estis fiksita je 100 μM kaj la PEG-koncentriĝo estis 15% (w/v).Por diversaj agregaj kondiĉoj, la αS:pLK-proporcio estis 1:10, dum la αS:ΔNt-Tau kaj αS:Tau441-proporcioj estis konservitaj je 1:1.Por ligado de titradaj eksperimentoj en foresto de amasiĝo, TEMPOL-122-αS estis konservita je 50 μM kaj polikatjonoj estis titigitaj ĉe kreskantaj koncentriĝoj, preparante ĉiun kondiĉon aparte.CW-EPR-mezuradoj estis faritaj per Bruker ELEXSYS E580 X-banda spektrometro ekipita per Bruker ER4118 SPT-N1-resonatoro funkcianta ĉe mikroonda (SHF) frekvenco de ~9.7 GHz.La temperaturo estis fiksita je 25 °C kaj kontrolita per likva nitrogena kriostato.La spektroj estis akiritaj sub nesaturitaj kondiĉoj je Mw-potenco de 4 mW, moduladamplitudo de 0.1 mT, kaj moduladfrekvenco de 100 kHz.Spektraj intensecoj estis normaligitaj por eviti diferencojn en spinkoncentriĝoj inter provaĵoj kaj ebla spinredukto pro restaj koncentriĝoj de reduktantaj agentoj en provaĵoj enhavantaj Tau441 aŭ ΔNt-Tau (ĉeestas en la originaj proteinsolvoj).La donitaj valoroj de g estis akiritaj kiel rezulto de EPR-spektra modelado farita per la programaro Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) efektivigita en Matlab®67.Unu/du komponentaj izotropaj modeloj estis utiligitaj por modeligi la datenojn.Post normaligado de ĉiuj signaloj, la restaĵoj estis kalkulitaj subtrahante ĉiun simuladon de la ekvivalenta eksperimenta spektro.Por ligado de titradanalizo, la relativa intenseco de la tria bando al la dua grupo de la normaligita EPR-spektro (IIII/III) estis uzata por monitori la ligon de polikatjonoj al αS.Por taksi la disigkonstanton (Kd), la rezulta kurbo estis konvenita al proksimuma modelo supozanta n identajn kaj sendependajn ligejojn.
NMR-spektroskopioeksperimentoj estis aranĝitaj per Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-spektrometro ekipita per kriosondilo kaj Z-gradiento.Ĉiuj eksperimentoj estis faritaj per 130-207 µM αS kaj ekvivalentaj αS/ΔNt-Tau kaj pLK en 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 kaj estis faritaj je 15 °C.Por monitori LPS per NMR, 10% PEG estis aldonita al la antaŭmiksitaj provaĵoj.La kemia movo perturba intrigo (Fig. 1b) montras la averaĝaj 1H kaj 15N kemiaj ŝanĝoj.La αS 2D1H-15N HSQC-spektroj estis asignitaj surbaze de antaŭa tasko (BMRB-eniro numero 25227) kaj konfirmitaj per registrado kaj analizado de la 3D-spektroj de HNCA, HNCO kaj CBCAcoNH.13Cα kaj 13Cβ kemiaj ŝanĝoj estis kalkulitaj en la ĉeesto de ΔNt-Tau aŭ pLK por mezuri eblajn ŝanĝojn en sekundaraj strukturaj tendencoj kompare kun αS-kemiaj ŝanĝoj en pura hazarda bobena formo 68 (Suplementa Bildo 5c).La R1ρ-tarifoj estis mezuritaj registrante hsqctretf3gpsi-eksperimentojn (akiritajn de la Bruker-biblioteko) kun prokrastoj de 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, kaj 800 ms, kaj la eksponentaj funkcioj estis alĝustigitaj al la pintintensaj prokrastoj ĉe malsama intenseco. fojojn determini la R1ρ kaj ĝian eksperimentan necertecon.
Dukoloraj temp-solvitaj fluoreskecaj mikroskopioeksperimentoj estis faritaj sur komerca temp-solvita fluoreska konfoka mikroskopo MT200 (PicoQuant, Berlino, Germanio) per tempo-korelacia ununura fotonkalkula aparato (TCSPC).La laserdiodkapo estas uzita por pulsita interplektita ekscito (PIE), la trabo pasas tra unureĝima ondgvidisto kaj estas agordita al laserpotenco de 10 ĝis 100 nW por 481 Nm kaj 637 Nm laserlinioj mezuritaj post dikroika spegulo.Ĉi tio certigas optimuman foton-nombran indicon, evitante la efikojn de foton-alising, fotoblankigado kaj saturiĝo.μ-Slide angiogenesis kovriloj aŭ platoj (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germanio) estis metitaj rekte en mergakvon super Super Apochromat 60x NA 1.2 lenso kun korekta kolumo (Olympus Life Sciences, Waltham, Usono).488/640 Nm dikroika spegulo (Semrock, Lago Arbaro, IL, Usono) estis utiligita kiel la ĉeftrabodividilo.Nefokusita radiado estas blokita de truo kun diametro de 50 mikronoj, tiam la fokusita radiado estas dividita en 2 detektajn vojojn per 50/50-radio.Bandpass-emisiofiltriloj (Semrock, Lago Arbaro, IL, Usono) 520/35 por verda tinkturfarbo (AF488) kaj 690/70 por ruĝa tinkturfarbo (Atto647N) estis uzitaj antaŭ la detektilo.Unu-fotonaj lavangodiodoj (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italio) estis utiligitaj kiel detektiloj.Kaj datumkolektado kaj analizo estis faritaj per la komerce havebla SymphoTime64-programaro (PicoQuant GmbH, Berlino, Germanio).
Kvindek mikrolitroj da LLPS-provaĵoj estis aplikitaj al μ-Slide-angiogenezaj putoj (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germanio).La rezultaj bildoj estas fokusitaj al 20 µm super la putfundo por optimuma objektiva labordistanco por suspenditaj gutetoj kaj al ~1 µm por flosoj kaj punktoj kun aksa rezolucio de almenaŭ 0.25 µm/pikselo kaj prokrastotempo de 400 µs/pikselo.Elektu datumojn aplikante intensecsojlon bazitan sur la averaĝa fonsigna intenseco (PBG, meznombro + 2σ) por ĉiu kanalo tiel ke nur likvaj proteingutoj, flosoj aŭ makuloj estu elektitaj, filtrante ajnan eblan originon de la disigita fazo.Por analizi la vivdaŭron de ĉiu specio (τ) de ĉiu kanalo (verda, "g" por AF488 kaj ruĝa, "r" por Atto647N), ni elektis interesajn regionojn (ROI) enhavantajn gutetojn, flosojn aŭ makulojn (Kuldona Figuro 1). ).8b) kaj derivis ilin ĝustigante ilian dumvivan kadukiĝon (τD, τR kaj τP por gutetoj, flosoj aŭ makuloj, respektive, vidu Suplementan Fig. 8c) en ĉiu kanalo uzante vost-taŭgan analizon kaj dukomponentan kadukiĝon.Mezumo τ de τ .ROI kiuj produktis tro malmultajn fotonojn por mult-eksponenta kongruo estis ekskluditaj de la analizo.La tranĉo uzita estis <104 fotonoj por flosoj kaj punktoj kaj 103 por gutoj.La gutetoj havas pli malaltan sojlon ĉar estas malfacile akiri kadukiĝkurbojn kun pli altaj intensecvaloroj, ĉar la gutetoj en la bildkampo estas kutime pli malgrandaj kaj malpli multaj.ROIoj kun fotonkalkuloj super la foton-amaslimo (metita al>500 kalkuloj/pikselo) ankaŭ estis forĵetitaj por analizo.Kongruu la intensan kadukiĝon akiritan de la regiono de intereso kun intenseco je 90% de la maksimumo (iom post la maksimuma intenseco de la kadukiĝo) de la komenco de la funkcidaŭro por certigi minimuman IRF-interferon konservante la saman por ĉiu intenseca kadukiĝo. agordoj Relativa tempofenestro Estis analizitaj 25 ĝis 50 ROI por flosoj kaj makuloj kaj 15-25 ROI por gutoj, bildoj elektitaj el pli ol 4 kopioj registritaj de almenaŭ 3 sendependaj eksperimentoj.Duvostaj t-testoj estis uzitaj por analizi statistikajn diferencojn inter specioj aŭ inter koacervatsistemoj.Por piksel-post-piksela analizo de la vivdaŭro (τ), la totala malfortiĝo de la vivdaŭro super la kampo por ĉiu kanalo estis kalkulita kaj proksimumado de 2/3-komponenta eksponenta malfortigmodelo estis aranĝita.La dumviva mildigo por ĉiu pikselo tiam estis konvenita uzante antaŭe kalkulitajn τ valorojn, rezultigante pseŭdokoloran FLIM-taŭgan bildon.La vost-konvena vivdaŭro estis la sama trans ĉiuj bildoj de la sama kanalo, kaj ĉiu kadukiĝo produktis sufiĉe da fotonoj por disponigi fidindan konvenon.Por FRET-analizo, pikseloj estis elektitaj aplikante pli malaltan intensecsojlon de 100 fotonoj, kiu averaĝis fonsignalon (FBG) de 11 fotonoj.La fluoreskeca intenseco de ĉiu kanalo estis korektita per eksperimente determinitaj korektaj faktoroj: 69 spektra interkruciĝo α estis 0.004, rekta ekscito β estis 0.0305, detekta efikeco γ estis 0.517.La FRET-efikeco sur la pikselnivelo tiam estas kalkulita uzante la sekvan ekvacion:
kie FDD estas la fluoreskecintenseco observita en la helpdona (verda) kanalo, FDA estas la fluoreskecintenseco observita en la akceptanto (ruĝa) kanalo sub nerekta ekscito, kaj FAA estas la fluoreskecintenseco observita en la akceptanto (ruĝa) kanalo sub rekta ekscito ( TORTO).Fluoreskecaj intensecpulsoj estas observitaj en la kanalo).
Metu 100 µl da LLPS-reagsolvoj enhavantaj 25 µM senetikedan monomeran Tau441 (kun aŭ sen 25 µM αS) en LLPS-bufron (aldonita kiel supre) sur nedevigaj 96-putoj mikroplatoj kun adhesiva folio tegaĵo kaj gutetoformado estis kontrolita post WF-mikroskopio. ekvilibrigo.ene de 10 min.Post 48 horoj da kovado ĉe ĉambra temperaturo, la ĉeesto de proteinflosoj kaj makuloj estis konfirmita.Tiam zorge forigu la likvaĵon super la flosoj el la putoj, tiam aldonu 50 L da disocia bufro (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) kaj kovu dum 10 min.La alta sala koncentriĝo certigas ke LLPS ne ripetos pro resta PEG, kaj eblaj proteinasembleoj formitaj nur per elektrostatikaj interagoj estos malmuntitaj.La fundo de la puto tiam estis zorge forskrapita per mikropipetpinto kaj la rezulta solvo estis transdonita al malplena observa puto.Post kovado de la specimenoj kun 50 μM ThT dum 1 h, la ĉeesto de izolitaj makuloj estis kontrolita per WF-mikroskopio.Preparu sonikatajn αS-fibrilojn per kovado de 300 µl de 70-µM αS-solvo en PBS kun pH 7,4, natria azido 0,01% je 37 °C kaj 200 rpm sur enorbita skuilo dum 7 tagoj.La solvo tiam estis centrifugata je 9600×g dum 30 minutoj, la buleto estis resuspendita en PBS pH 7.4 kaj sonikita (1 min, 50% ciklo, 80% amplitudo en Vibra-Cell VC130 sonikatoro, Sonics, Newton, Usono) fibrilaj specimenoj. kun relative unuforma granddistribuo de malgrandaj fibriloj.
FCS/FCCS-analizo kaj dukolora koincido-detekto (TCCD) estis faritaj sur la sama MT200 temp-solvita fluoreska konfokusa mikroskopo (Pico-Quant, Berlino, Germanio) uzita por la FLIM-FRET-mikroskopioeksperimentoj uzante la PIE-reĝimon.La laserpotenco por tiuj eksperimentoj estis aldonita al 6.0 µW (481 Nm) kaj 6.2 µW (637 Nm).La kombinaĵo de tiuj laseraj potencoj estis elektita por produkti similan brilecon por la paroj de fluoroforoj uzitaj dum atingante optimumajn kalkultarifojn kaj evitante fotoblankigadon kaj saturiĝon.Kaj datenkolektado kaj analizo estis faritaj per la komerce havebla SymphoTime64 versio 2.3 softvaro (PicoQuant, Berlino, Germanio).
Provaĵoj de izolitaj αS/Tau-agregaĵoj akiritaj uzante LLPS estas diluitaj en izolitbufro al la konvena monomolekula koncentriĝo (tipe 1:500 diluo, ĉar agregaĵoj jam estas ĉe malaltaj koncentriĝoj kiam izolitaj de koacervatprovaĵoj).Specimenoj estis aplikitaj rekte al kovriloj (Corning, Usono) antaŭkovritaj per BSA-solvo je koncentriĝo de 1 mg/mL.
Por la PIE-smFRET-analizo en la verdaj kaj ruĝaj kanaloj, pli malalta intensecsojlo de 25 fotonoj estis aplikita por filtri malaltajn intensecajn signalojn kaŭzitajn de monomeraj okazaĵoj (notu ke monomeroj plimultas ol agregitaj specimenoj kompare kun izolitaj agregaĵoj).Ĉi tiu sojlo estis kalkulita kiel kvinoble la meza intenseco de monomera αS akirita de la analizo de puraj monomerprovaĵoj por specife elekti agregaĵojn por analizo.La PIE-veturadcirkvito, kune kun TSCPC-datumakiro, ebligis la aplikon de dumviva pezfiltrilo kiu helpas elimini fonon kaj spektran krucparoladon.La flamintenseco elektita uzante la suprajn sojlojn estis korektita per la averaĝa fonsignalo determinita de la histogramoj de okazo kontraŭ intenseco/ujo de la nuraj bufro-specimenoj.Eksplodoj asociitaj kun grandaj agregaĵoj tipe okupas plurajn sinsekvajn rubujojn en la tempospuro (metita al 1 ms).En ĉi tiuj kazoj, ujo de maksimuma forto estis elektita.Por FRET kaj stoiĥiometria analizo, la teorie determinita gama-faktoro γ (0.517) estis uzita.Spektra interparolado kaj rektaj ekscitkontribuoj estas nekonsiderindaj (determinitaj eksperimente) ĉe la ekscita laserpotenco uzita.La efikeco kaj stoiĥiometrio de FRET en eksplodo estas kalkulitaj jene.