347 neoksidebla ŝtalo volvita tubo kemia komponento, Identigo de novaj interferon-respondemaj homaj leukocitaj antigeno-A (HLA-A) ŝaperonproteinoj uzante kruc-ligitan mas-spektrometrion (CLMS)

Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.
Glitiloj montrante tri artikolojn per diapozitivo.Uzu la malantaŭan kaj sekvan butonojn por moviĝi tra la lumbildoj, aŭ la butonojn de glit-regiloj ĉe la fino por moviĝi tra ĉiu lumbildo.

Priskribo de la produkto

Neoksidebla Ŝtalo 347L Bobenaj Tuboj, Ŝtalo Grado: SS347L

La interferona signalsistemo induktas fortan citokinrespondon al larĝa gamo de patogenaj kaj internaj patologiaj signaloj de la medio, rezultigante la indukton de subaroj de interferon-indukteblaj proteinoj.Ni aplikis DSS-mediaciitan krucligan mas-spektrometrion (CLMS) por detekti novajn protein-proteinajn interagojn en la domajno de interferon-induktitaj proteinoj.Krom la atendataj interferon-indukteblaj proteinoj, ni ankaŭ identigis novajn intermolekulajn kaj intramolekulajn krucligitajn aduktojn de kanonikaj interferon-indukteblaj proteinoj kiel MX1, USP18, OAS3 kaj STAT1.Ni koncentriĝis pri orta validigo de nova aro de interferon-indukteblaj proteinretoj formitaj de HLA-A-proteinoj (H2BFS-HLA-A-HMGA1) uzante ko-imunoprecipitadon kaj ilian pluan studon uzante molekula dinamikan modeladon.Modeligado de la konformiga dinamiko de la proteinkomplekso rivelis plurajn interagadejojn kiuj reflektis la interagojn identigitajn en la CLMS-trovoj.Kune, ni prezentas pilotstudon de CLMS por identigi novajn signalajn kompleksojn induktajn de interferono, kaj antaŭĝojas pri la pli larĝa uzo de CLMS por identigi novan dinamikon de proteininteragoj en la tumormikromedio.
Antaŭ ol adapta imunreago komenciĝas, la denaska defendsistemo de la gastiganto muntas kontraŭmikroban respondon mediaciitan fare de familio de kaŝitaj alfa-helikformaj citokinoj nomitaj interferonoj (IFNoj).La tipo I IFN-klasoj IFNα kaj IFNβ aktivigas ĉelajn respondojn, inkluzive de kontraŭvirusaj, proapoptozaj, proinflamaj, kaj kontraŭproliferativaj ŝtatoj.En homoj, 13 subtipoj de IFNα estas konataj, ĉiuj amasigitaj sur kromosomo 91. Surprize, nur IFNα2 estis studita por klinika uzo.Lastatempe, speciala atento estis pagita al esplorado pri aliaj subtipoj de IFNα.Lastatempa studo montris ke IFNα14 estas unu el la plej efikaj izoformoj en limigado de HBV2 kaj HIV-13,4-reproduktado komparite kun la kanonika IFNα2-subtipo.
Estis konstatite ke aktivigitaj tipo I interferon-receptorokompleksoj (IFNAR1 kaj IFNAR2) ekigas signal-transduktan kaskadon mediaciitan per Janus-kinazoj TYK2 kaj JAK15,6.Tiuj Janus-kinazoj fosforilas signaltransduktilojn kaj transkriptajn proteinaktivilojn (STAT1 kaj STAT2) sur tirozinrestaĵoj por iniciati SH2-domajn-mediaciitan heterodimerigon6.Poste, IRF9 ligas STAT-heterodimerojn por formi trimeran komplekson de la IFN-stimulita faktoro 3 geno (ISGF3), kiu translokiĝas al la nukleo kaj induktas la transskribon de pli ol 2000 interferon-stimulitaj genoj (ISG)5,6,7,8.
ISGoj formas la spinon de la denaska imunsistemo, precipe en respondo al virusatako.Kiel unua linio de defendo kontraŭ virusinfekto, ĉeloj rapide deplojas ampleksajn interagojn de ĉelaj proteinoj kun larĝa gamo de biologiaj agadoj.Tiuj proteinoj inkludas padronrekonajn receptorojn, signalajn molekulojn, transkripcifaktorojn kaj proteinojn kun rektaj kontraŭvirusaj funkcioj, same kiel negativajn reguligistojn de imunreagoj9.Multo de la informoj pri ISG-agado venas de funkciaj ekranoj uzantaj troesprimajn ekranojn10,11 aŭ genajn silentigteknikojn (siRNA, RNAi kaj CRISPR)12,13 en kiuj individuaj ISGoj estas esprimitaj aŭ inhibiciitaj kaj ilia agado estas testita sur diversaj virusoj.Kvankam tiuj studoj determinis la kontraŭvirusajn trajtojn de individuaj ISGoj, la subestaj molekulaj mekanismoj de ĉiu ISG restas plejparte nekonataj.Estas ĝenerale akceptite ke multaj proteinoj interagas kun unu aŭ pluraj citokinoj por certigi plenan agadon, tiel ke aŭ ISGoj interagas rekte aŭ iliaj interagoj estas mediaciitaj per ĉelaj proteinoj.Ekzemple, lastatempa fotokrucigita proteomiko studo identigis ATPase VCP/p97 kiel grava IFITM3-interaga partnero, kies inhibicio kondukas al difektoj en lizozoma ordigo, spezo kaj kuntransporto de IFITM3 kun viruspartikloj 14 .Uzante imunoprecipitadon, ni identigis VAPA, vezik-asociitan proteinon, kiel interaga partnero kun IFITM1/2/3, kiu mediacias kolesterol-mediaciitan virusmaturiĝon, kaj tio estis konfirmita per alia studo uzanta giston du-hibridan sistemon.Scienca Subteno 15 , 16 .
Fundamenta biologia procezo implikita en la subpremado de infekto kaj maligna transformo estas antigenprezento, kiu estas mediaciita per gravaj histokongrueckomplekso (MHC) molekuloj.Peptidoj (8-12 aminoacidoj longaj) de fenditaj, trofrue finitaj aŭ misfalditaj proteinoj estas ŝarĝitaj en la MHC-I heterodimero (konsistanta el MHC-I pezaj kaj malpezaj ĉenoj, nomitaj β-2-mikroglobulino; β2M) 17,18 .La rezultaj stabilaj MHC-I-trimeroj estas transportitaj al la ĉela surfaco, kie ili prezentas intraĉelajn peptidojn al CD8+ T-ĉeloj (citotoksaj T-ĉeloj)17.T-ĉeloj rekonas kaj detruas tiujn patogenojn kaj ĉelojn portantajn tumor-specifan antigenon.Sekve, patogenoj kaj tumorĉeloj ofte subpremas la antigenan prezentprocezon por eviti imungvaton.Krome, MHC-I estas subreguligita en 40-90% de homaj tumoroj kaj ofte estas asociita kun pli malbona prognozo19.
Genoj implikitaj en respondado al patogenoj devas rapide ŝanĝi inter stato de ripozo kaj stato de aktiva transskribo.Tial, pluraj ĉelaj proteinoj estas hipotezitaj esti implikitaj en la respondo al alta IFN-postulo dum mallongaj tempodaŭroj, inkluzive de restrukturado kaj modifo de reklamanto-kromatino 20,21.La plej multaj studoj temigis la identigon de individuaj ISG-proteinpartneroj en la ĉeesto de IFN.Pluraj proteomiaj kaj transcriptomaj studoj en modelĉelsistemoj pliklarigis la efikon de IFN sur la ĉela pejzaĝo.Tamen, malgraŭ kreskanta kompreno pri la dinamiko induktita de interferonoj, ni ankoraŭ malmulte scias pri la implikiĝo de ISGoj.Dum pripensado de la komplekseco kaj temp-dependa dinamiko de interferonsignalado, du demandoj ekestas: (i) ĉu estas eble stabiligi kaj kapti la multiproteinkompleksojn implikitajn en rapida signalado, kaj (ii) ĉu tiuj interagoj povas esti mapitaj en 3D-spacon?
Por trakti ĉi tiujn problemojn, ni efektivigis disuccinimide suberate-mediata kemia krucligo (DSS) kunigita kun masa spektrometrio (CLMS) por studi la IFNα-induktita proteina interaga reto kaj ĝia dinamiko.DSS aldonas kovalentajn ligojn inter proksimalaj restaĵoj de proteinoj kaj/aŭ proteinkompleksoj en vivo.Posta MS-analizo rivelas specifajn interligajn ejojn kiuj reflektas la spacan proksimecon de regionoj ene de speciala proteino, nomitaj internaj ligoj, aŭ subunuoj en proteinkompleksoj, nomitaj interrilatoj.Uzante ĉi tiun aliron, ni identigis plurajn novajn protein-proteinajn kompleksojn same kiel interferon-induktitajn multproteinajn interagajn retojn.Plue provante subaron de ĉi tiuj novaj interagoj, ni pruvas, ke H2BFS (H2B histon-speca FS; ĉi-poste nomata H2B) kaj MDN1 agas kiel ligantaj partneroj por HLA-A.
Flo-1-ĉeloj estas unu el la plej konataj en vitro modeloj de ezofaga adenokarcinomo ĉar ili imitas ŝlosilajn trajtojn de ezofagaj tumoroj22,23.Tamen, ne ĉiuj tumoroj estas imunogenaj, kaj por determini ĉu Flo-1-ĉeloj respondas al interferona traktado, ni traktis Flo-1-ĉelojn kun 10 ng/ml IFNα dum 72 horoj.Flo-1-ĉeloj montris fruan indukton de pSTAT1 kaj IRF1, komencante 2 horojn post kuracado kaj daŭrante dum 72 horoj, kun tempodependa malkresko de senmovaj niveloj de IRF1 (Figuro 1A).ISGoj (MX1, IFITM1, OAS1/2 kaj ISG15) estis trovitaj forte induktitaj post 6 horoj, imitante la klasikajn mezajn kaj malfruajn fazajn respondojn al IFNα (Figuro 1A).Kune, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke ĉi tiu ĉela modelo povas esti uzata por studi interferonrespondojn.
Diferencaj protein-esprimrespondoj en Flo-1-ĉeloj post IFNα-traktado.(A) Proteina esprimo en Flo-1-ĉeloj traktitaj kun 10 ng/ml IFNα dum 2, 6, 24, 48 kaj 72 horoj estis analizita per immunoblot uzante la indikitajn ISG-antikorpojn.(B) Coomassie bluaj makulitaj SDS-PAGE-ĝeloj de tutaj ĉelaj eltiraĵoj post krucligo kun DSS por indikitaj tempoj kaj koncentriĝoj.(C) Reprezenta imunblot ekzamenita kun p53 (DO-1) antikorpo de la samaj provaĵoj por taksi la gradon de protein-krucligo.
Por kapti la surlokan proteininteragadpejzaĝon, ni uzis DSS, vaste uzatan interligan agenton pro ĝia alta membranpermeablo kaj relative mallonga reagtempo.La pli mallonga reagtempo helpas malhelpi la formadon de grandaj agregaĵoj de krucligitaj proteinoj, tiel konservante la stabilecon de la krucliganto.Por determini la optimuman DSS-koncentriĝon kaj eviti tro-krucigadon, ni unue elmontris la ĉelojn al 5, 2.5, kaj 1 mM DSS dum 5, 10, 5 kaj 30 minutoj respektive, kaj analizis la lisatojn per Coomassie-makula SDS-PAGE. (datenoj ne montritaj).Ĉellisatoj ŝajnas esti tre krucligitaj ĉe la plej malsupra koncentriĝo kaj ĉe la plej mallonga tempopunkto.Tial, DSS estis titolita al 1, 0.5, kaj 0.1 mM dum 5 minutoj (Figuro 1B).Optimuma krucligo estis observita kun 0.5 mM DSS dum 5 minutoj, kaj ĉi tiuj kondiĉoj estis elektitaj por ĉeloj traktitaj kun IFNα.Krome, Figuro 1C montras okcidentan blot faritan uzante la p53 (DO-1) antikorpon por taksi la gradon de protein-krucligo.
Flo-1-ĉeloj estis traktitaj kun 10 ng/ml IFNα dum 24 horoj antaŭ aldoni la krucliganton.Kruc-ligitaj ĉeloj poste estis lizitaj per du-paŝa proteolizo kaj proteinoj estis prilaboritaj per FASP (Fig. 2)24,25.Kruc-ligitaj triptikaj peptidoj estis analizitaj per mas-spektrometrio (Fig. 2).La MS/MS-spektroj tiam estas egalitaj al la proteinsekvenco kaj kvantigitaj kun MaxQuant26,27.Kruc-ligitaj peptidoj estis identigitaj de la akiritaj spektroj uzante la SIM-XL-programon, kaj individuaj komponaĵoj estis kombinitaj en kompleksan reton uzante la malfermfontajn komputikajn programajn duktoj xQuest28 kaj SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL identigas protein-proteinajn interagojn, internajn ĉenojn kaj individuajn ĉenojn en simplaj aŭ kompleksaj proteinmiksaĵoj kaj disponigas manuskriptojn por bildigado de interagoj en proteinstrukturoj.Krome, ĝi vicigas ĉiun krucreferencon kiel ID-poentaro laŭ la MS/MS29-spektra kvalito.Pluraj tre fidindaj protein-proteinaj interagoj kaj kompleksoj estis identigitaj, kaj nova aro de interagoj estis plue esplorita uzante ko-immunoprecipitation kaj konformaj ŝanĝoj de kompleksoj uzante molekula dinamika (MD) modelado (Fig. 2) 30, 31.
Skema superrigardo de la CLMS-metodo.Flo-1-ĉeloj estis traktataj per 10 ng/ml IFNα dum 24 horoj sekvitaj de surloka proteina krucligo uzante DSS sekvitan de ĉela lizo kaj tripsinigo.Krucligitaj provaĵoj estis analizitaj per mas-spektrometro Orbitrap kaj plue provitaj por fragmentiĝo de peptidaj antaŭuloj dum LC-MS/MS.Du ligitaj peptidoj estis identigitaj de la akiritaj spektroj per la programo de Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL), kaj ĉiuj kunmetaĵoj estis kombinitaj en kompleksan reton uzante komputilajn duktojn.Filtru malaltajn konfidajn interagojn bazitajn sur malvera pozitiva indico (FDR) poentoj.Pluraj novaj altfidelecaj protein-proteinaj interagoj estis plu konfirmitaj uzante ko-imunoprecipitadon, kaj konformaj ŝanĝoj en la kompleksoj estis ekzamenitaj uzante molekula dinamikan (MD) modeligadon.
Entute ~ 30,500 kaj ~ 28,500 peptidoj estis detektita uzante MaxQuant en nestimulitaj kaj stimulitaj specimenoj de IFNα, respektive (Suplementa Tabelo S1, Fig. 3A).La peptidlonga distribuo en ambaŭ kazoj montris pli altan proporcion de pli grandaj peptidoj, indikante la ĉeeston de kruc-ligitaj peptidoj (Fig. 3B, C).Krome, pli granda proporcio de pli grandaj peptidoj ĉeestis en la 40-55 gamo en IFNα-traktitaj specimenoj (Fig. 3C).Proteina mapado kontraŭ log2-intenseco montris, ke klasikaj interferon-stimulitaj proteinoj estis la plej abundaj kompare kun netraktitaj specimenoj, inkluzive de MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 kaj HLA-F (Figuro 3D).Analizo de vojoj por proteinoj pli ol trioble riĉigitaj en respondo al IFNα-traktado uzante la Reactome-vojan datumbazon montris, ke MHC-I-mediata antigena prezento kaj pretigo estis la plej domina vojo (Figuro 3E).Konsekvence kun pli fruaj raportoj, kontraŭvirusaj respondoj mediaciitaj de OAS kaj ISG15 same kiel IFNα/β kaj citokinsignalado estis inter la vojoj aktivigitaj.Krome, lizin- kaj serin-specifaj proteininterligoj estis identigitaj de la origine akiritaj MS/MS-spektroj uzante SIM-XL.Lastatempa studo raportis 104 ISG-ojn enhavantajn 20 virusojn de 9 virusklasoj per metaanalizo de individuaj ISG-troesprimstudoj en 5 ĉeltipoj9.Tamen, por venki la komputilajn limigojn pri ekzamenado de grandaj datumaroj, ni komencis per pli malgranda datumaro por esplori eblajn interagojn inter la listo de IRDS-genoj raportitaj de Padaria et al., la plej multaj el kiuj estas ISG-oj.
Identigo de diferencige esprimitaj kruc-ligitaj proteinoj en respondo al IFNα (datenoj akiritaj de MaxQuant).(A) Venn-diagramo reprezentanta la nombron da komunaj kaj ekskluzivaj peptidoj identigitaj en IFNα14 traktitaj kaj netraktitaj Flo-1-provaĵoj.Peptida longodistribuo de netraktitaj (B) kaj IFNα traktitaj (C) krucligitaj provaĵoj.(D) Varmomapo reprezentanta log2 (LFQ-intenseco) inter netraktitaj kaj IFNα14 traktitaj Flo-1-ĉeloj.La maldekstra panelo montras la proteinojn plej aktive aktivigitajn en la ĉeesto de IFNα.(E) Histogramo reprezentanta la 20 ĉefajn riĉigajn vojojn post IFNα-traktado.La Reactome-vojdatumbazo analizis pli ol kvaroblajn ŝanĝojn en suprenreguligitaj IFNα-respondemaj proteinoj.
Interferon-mediaciita ISG-stimulo estas bone dokumentita, sed sur la molekula nivelo estas nebone komprenite kiel tiuj proteinoj kulminas per larĝa gamo de biologiaj funkcioj.Ni esploris proteinajn interagojn kun alta grado de fido inter konataj ISG-oj.Kurioze, ni identigis reton inkluzive de proteinoj MX1, USP18, ROBO1, OAS3 kaj STAT1, kiuj formas grandan komplekson en respondo al IFNα-traktado (Figuro 4, Tabelo S2) 32,33,34.Plej grave, ĉi tiuj interagoj estis trovitaj en ĉiuj trioblatoj traktitaj kun IFNα kaj ne estis trovitaj en netraktitaj provaĵoj, sugestante ke ili estis formitaj specife en respondo al IFNα-traktado.Estas konata ke STAT1 transkribe reguligas la esprimon de tiuj ISGoj, sed ĝia interagado kun ISGoj sur la proteinnivelo ne estis studita.La kristala strukturo de STAT1 montris, ke ĝia helikforma domajno (CCD) ne estas implikita en la interagado kun DNA aŭ protomeroj dum la formado de dimeroj35.Tiuj α-helicoj formas helikforman helicstrukturon kiu disponigas ĉefe hidrofilan surfacareon por interagoj por okazi 35 .En niaj CLMS-datumoj, ni observis, ke la plej multaj el la interagoj kun STAT1 okazis en la SH2-domajno antaŭ la CCD, la ligilo-domajno aŭ la C-fina vosto (restaĵoj 700-708) (Figuro 4A).Antaŭa studo raportis, ke USP18 ligas al la CCD kaj DNA-liganta domajno (DBD) de STAT2 kaj estas rekrutita al la subunuo de la tipo I interferonreceptoro IFNAR2 por mediacii inhibicion de tipo I interferona signalado 24 .Niaj datumoj ankaŭ montris, ke la kataliza domajno USP18 interagas kun STAT1 DBD (Figuro 4A, D), sugestante, ke kaj STAT1 kaj STAT2 povas ludi rolon en altiri USP18 al IFNAR2.
Protein-proteina ISG-reto identigita en kruc-ligitaj ĉeloj traktitaj kun IFNα.(A) 2D-interago-intrigo montranta protein-proteinajn interagojn (generitajn en la SIM-XL-programo), kun linioj reprezentantaj intermolekulajn interagojn (krucliga tranĉo metita al 3.5).Domajnoj de malsamaj identecoj estas markitaj per sia koloro32: MX1-domajno, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), kaj GED (569-660).OAS3-domajnoj: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), kaj OAS1_C (903-108).Domajno ROBO1, Ig_3 (67–151), I-aro (170–258), I-aro (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) kaj fn3 (777–864).STAT1-kampoj: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), kaj STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Cirkla spektanto de kruc-ligitaj proteinoj (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 kaj STAT1) kun interagoj kaj interagoj etikeditaj en blua kaj ruĝa, respektive.La krucliga sojlo estis fiksita ĉe 3.5.Punkt-intrigoj indikas STAT1-interagejojn kun MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), kaj OAS3 (F), same kiel K aŭ S-interagejojn inter la du peptidoj.En la figuro, la krucliga poentarsojlo estas fiksita al 3.0.(G) Diversaj interagadejoj inter STAT1 kaj OAS3 DI-domajnoj supermetitaj sur siaj proteinstrukturoj en PyMol (PyMOL molekula grafika sistemo, versio 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) kaj OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programo.
Du izoformoj de USP18 estis priskribitaj en homoj, plenlonga proteino kiu situas ĉefe en la nukleo, kaj izoformo sen N-fina domajno, USP18-sf, kiu estas egale distribuita en la citoplasmo kaj nukleo 36 .Krome, la N-finstacio estis antaŭdirita esti nestrukturita kaj ne postulas izopeptidazaktivecon aŭ ISG1537-ligadon.Plej multaj el la interagoj identigitaj en nia studo situis ĉe la N-finaĵo de la proteino, sugestante, ke ĉi tiuj interagoj implikas plenlongan USP18 (Figuro 4A, D) kaj tiel verŝajne okazas en la kerno.Plie, niaj datumoj ankaŭ indikas, ke la N-finaĵo estas specialigita por protein-al-proteinaj interagoj.La IFNAR2-liga loko situas inter restaĵoj 312-368, kaj precipe, neniu el la proteinoj en la komplekso ligas al ĉi tiu regiono (Fig. 4A) 37,38.Tiuj datenoj prenitaj kune indikas ke la IFNAR2-liga domajno estas ekskluzive uzita per la receptorproteino.Krome, nur OAS3 kaj ROBO1 estis trovitaj esti asociitaj kun domajnoj kontraŭflue de la N-finstacio kaj IFNAR2-liga loko (Figuro 4A).
ROBO1 apartenas al la superfamilio de imunglobulinoj (Ig) de transmembranaj signalaj molekuloj kaj konsistas el kvin Ig-domajnoj kaj tri fibronektin (Fn) domajnoj en la eksterĉela regiono.Ĉi tiuj eksterĉelaj domajnoj estas sekvataj de membran-proksima regiono kaj ununura transmembrana helico 39. Senstruktura intraĉela regiono situas ĉe la C-finaĵo kaj enhavas konservitajn sekvencmotivojn kiuj mediacias efikproteinan ligon39.La regiono etendiĝanta de aminoacidoj ~1100 ĝis 1600 estas plejparte malorda.Ni trovis, ke MX1 interagas kun ROBO1 tra Ig, Fn kaj intraĉelaj domajnoj, dum la plej multaj interagoj kun STAT1 okazas inter ĝia CCD, liganto-domajno kaj la C-finaĵo de ROBO1 (Fig. 4A, E).Aliflanke, interagoj kun DI, DIII kaj OAS3-ligaj regionoj estis distribuitaj tra la ROBO1-proteino (Fig. 4A).
La oligoadenylate synthase (OAS) proteinfamilio akceptas kaj ligas intraĉelan duoble-fadenan RNA (dsRNA), spertas konformajn ŝanĝojn, kaj sintezas 2′,5′-ligitajn oligoadenilatojn (2-5 As) 40 .Estis trovite ke inter la tri OAS-oj, OAS3 elmontras la plej altan afinecon por dsRNA kaj sintezas la malplej kvanton de 2-5 As, kiu povas aktivigi RNase L kaj tiel limigi virusreproduktadon 41 .La OAS-familio konsistas el polimerazo beta (pol-β)-similaj nukleotidtransferazdomajnoj.Antaŭa esplorado montris ke la kataliza agado de la C-fina domajno (DIII) estas dependa de la dsRNA-liganta domajno (DI), kiu estas postulata por la aktivigo de OAS342.Ni observis, ke la DI kaj DII-domajnoj de OAS3 interagas kun CCD kaj malgranda krucvojo inter SH2 kaj STAT1 TAD (Figuro 4A, F).Supermeti malsamajn interligajn ejojn sur la proteina strukturo malkaŝis interagon inter la β-folio kaj DBD STAT1-buklo kaj malferma poŝo aŭ kavo formita de restaĵoj 60-75 en la DI-domajno de OAS3 (Fig. 4G).La orientiĝo de la proteinoj en la komplekso ankaŭ indikis ke neniu el la interagoj kun OAS3 interferis kun la DNA-liga kapableco de ĝia DI-domajno (Fig. S1A).Krome, la N-fina domajno de GTPase MX1 interagas vaste kun la DI kaj DIII-domajnoj de OAS3 (Fig. 4A).Ni ankaŭ observis interagadon inter OAS1 kaj MX1 en ĉiuj tri IFNα-traktitaj ripetoj, kie ununura OAS1-domajno (ankaŭ katalize aktiva) interagis kun ĉiuj tri MX1-domajnoj (Figuro S2A, B).
MX-proteinoj estas parto de granda familio de dinein-similaj GTPasoj kiuj enhavas N-finan GTPase-domajnon kiu ligas kaj hidrolizas GTP, mezan domajnon kiu mediacias mem-kunigon, kaj C-finan leŭcinzipon kiu funkcias kiel GTPazo (LZ). ).domajna efekta domajno25,43.MX1 ligas al subunuoj de viruspolimerazoj por bloki transskribon de la virusgeno43.Antaŭe raportita gisto du-hibrida ekrano montris ke PIAS1-asociita MX1 malhelpas STAT1-mediaciitan genaktivigon blokante DNA-ligan agadon kaj ankaŭ havas SUMO E344,45 ligase-agadon.Ĉi tie, ni pruvas, ke MX1 ligas al STAT1 (Figuro 4C, D), tamen kiel ĉi tiu interago influas STAT1-mediaciitan genan aktivigon en respondo al IFNα bezonas plian studon.Krome, ni ankaŭ trovis, ke MX1 interagis kun IFIT3 kaj DDX60 en ĉiuj tri IFNα-traktitaj ripetoj (Fig. S2C).
DDX60 estas IFN-induktita citoplasma helicazo kiu antaŭe estis raportita ludi rolon en RIG-I-sendependa degenero de virus RNA46.Ĝi interagas kun RIG-I kaj aktivigas sian signaladon en ligand-specifa maniero 46. DDX60 konsistas el DEXD/H-Box-helikaza domajno kaj C-fina helikaza domajno kiuj ligas virusan RNA kaj DNA47.La plej multaj el ĝiaj interagoj kun MX1 kaj IFIT3 okazas ene de longaj N- kaj C-finaj regionoj sen kanonaj domajnoj aŭ ĉeftemoj (Fig. S2E, F).Tamen, MX1 ankaŭ estas rilata al la DEXD/H-Box helicase-domajno (Fig. S2E).Proteinoj de la IFIT-familio havas tandemajn kopiojn de karakteriza helic-turn-helicmotivo nomita la tetrapeptida ripeto (TPR).IFIT3 estis trovita esti pozitiva modulatoro de RIG-I signalado kaj tial komponento de la MAVS-komplekso.Kunigitaj, niaj datumoj sugestas, ke IFIT3 kaj DDX60 interagas ĉefe en la regiono inter TPR 3-6 de IFIT3 kaj povas ludi rolon en RIG-I/MAVS-signalado (Fig. S2F).
Konsiderante ke ekzamenado de la tuta proteomo estas komputile intensa, ni tiam ekzamenis la tutan homan UniProt-datumbazon por la ĉeesto de unu el la IFNα-traktitaj ripetoj.En ĉi tiu kopio, ni trovis plurajn tre fidindajn interagajn retojn por HLA-A.Analizo de proteinaj vojoj identigitaj de MS/MS-spektroj montris, ke MHC-I-bazita antigena prilaborado kaj prezento estas la ĉefa vojo induktita de interferono (Fig. 3D).Tial ni koncentriĝis pri studado de la proteininteragoj de MHC-I-molekuloj kun alta grado de fido en ĉiuj kruc-ligitaj specimenoj.HLA konsistas el α1, α2 kaj α3 domajnoj kaj malpezaj ĉenoj, kaj mikroglobulino β2 (β2m) estas konstanta ŝaperona proteino49.Post kiam kunvenita en la endoplasma retikulo, HLA estas malstabila en la foresto de peptidperantoj50.La peptid-liga kanelo estas formita per la tre polimorfaj kaj nestrukturitaj α1 kaj α2 domajnoj en ne-peptida formo kaj la relative malpli polimorfa α351-domajno.En la ĉeesto de IFNα, ni detektis du HLA-A-kompleksojn: unu interagas kun HMGA1 kaj H2B (Figuro 5, Tabelo S3) kaj la alia interagas kun MDN1, LRCH4 kaj H2B (Figuro 6).
IFNα stimulas HLA-A-interagadan reton kun H2B (H2BFS) kaj HMGA1.(A) 2D intrigo (generita en SIM-XL-softvaro) prezentanta malsamajn specojn de interagoj en la H2B-HLA-A-HMGA1-komplekso: interligo (blua), interligo (ruĝa) kaj ununura ligo (nigra)..Domajnoj de malsamaj identecoj estas kolorkodigitaj32: H2B (histone; 2-102) kaj MHC-I (MHC_1; 25-203, grupo C1; 210-290 kaj MHC_I_C; 337-364).La krucliga sojlo estis fiksita ĉe 3.5.Punkt-intrigoj indikas HLA-A-interagejojn kun H2B (B) kaj HMGA1 (C), same kiel K aŭ S-interagejojn inter la du peptidoj.En la figuro, la krucliga poentarsojlo estas fiksita al 3.0.(D) Rilatoj inter proteinoj montritaj en la strukturoj de la H2B, HLA-A, kaj HMGA1-proteinoj en la PyMOL-programo.Tiuj strukturoj estis modeligitaj uzante la Phyre2-servilon (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kaj la ŝablonstrukturoj por la H2B, HLA-A kaj HMGA1-proteinoj estis 1kx552, 1kj349 kaj 2eze55, respektive.
IFNα induktas HLA-A-interagadan reton kun H2B (H2BFS), MDN1 kaj LRCH4.(A) Intermolekulaj (ruĝaj) kaj intermolekulaj (bluaj) krucligiloj prezentitaj sur 2D interaga mapo (generita en SIM-XL-programaro) kun MDN1 reprezentita kiel cirklo.La krucliga sojlo estis fiksita ĉe 3.5.Domajnoj de malsamaj identecoj estas kolorkodigitaj32: H2B (histone; 2-102), MHC-I (MHC_1; 25-203, grupo C1; 210-290 kaj MHC_I_C; 337-364) kaj LRCH4 (LRR_8 (68-126), LRR_8 (137–194) kaj CH (535–641)).(B) Rilatoj inter proteinoj montritaj en la strukturoj de la H2B, HLA-A, LRCH4, kaj MDN1-proteinoj en la PyMOL-programo.Tiuj strukturoj estis modeligitaj uzante la Phyre2-servilon (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) kun ŝablonstrukturoj 1kx552, 1kj349, 6hlu62 kaj 6i2665 por la H2B, HLA-A, LRCH4 kaj MDN1 proteinoj, respektive.Punktaj intrigoj montrantaj K aŭ S-interagajn lokojn por HLA-A kun H2B (C), LRCH4 (D), kaj MDN1 (E).Por intrigoj, la krucliga poentarsojlo estis fiksita al 3.0.
Aldone al konservado de la integreco de la genaro, histono H2B ankaŭ estas implikita en la reguligo de transskribo.La H2B-proteino konsistas el centra histondomajno (HFD) formita de tri α-helicoj apartigitaj per bukloj kaj C-fina vosto 41,52.La plej granda parto de la interagado kun H2B okazas en la α1-helico, kiu provizas trimerigon per la HFD-heterodimero (Fig. 5A,B).Kvankam lizoj estas implikitaj en DNA-ligado, kelkaj lizoj ankaŭ estas alternativaj acetiligo aŭ metiligejoj.Ekzemple, restaĵoj K43, K46, kaj K57 de H2B ne estas implikitaj en rekta DNA-ligado, sed estas celoj de diversaj post-transskribaj modifoj53.Simile, restaĵoj K44, K47 kaj K57 en H2B povas ludi alternativan rolon en la ĉeesto de IFNα, inkluzive de interagoj kun aliaj proteinoj (Fig. 5A, B).Krome, la eksterkromosoma histono H2B aktivigas la imunreagon en diversaj ĉeltipoj, funkciante kiel citosola sensilo por detekti duoble-senhelpan DNA (dsDNA) fragmentojn derivitajn de infektaj agentoj aŭ difektitaj ĉeloj54.En la ĉeesto de DNA-virusoj, H2B malplenigo malhelpis IFN-β-produktadon kaj STAT154-fosforiligon.H2B ankaŭ povas moviĝi en kaj el la nukleo pli rapide ol aliaj kernhistonoj54.H2B-interagoj kun MDN1 kaj LRCH4 ankaŭ estis observitaj en elektitaj netraktitaj provaĵoj.Ni trovis, ke HLA-A interagis kun H2B en ĉiuj tri IFNα-traktitaj specimenoj kaj en unu netraktita ripeta specimeno.Ĉi tiuj datumoj reflektas la rolon de H2B en alternativa fiziologia funkcio sendependa de transskriba reguligo.
HMGA1 (alta moviĝeblogrupo AT-Hoko 1), malgranda nukleoproteino riĉa je malsan-antaŭenigantaj aminoacidoj, estis identigita en unuiĝo kun HLA-A.Ĝi havas acidan C-finan voston kaj tri apartajn DBDojn nomitajn AT-hokoj ĉar ili ligas al la negrava kanelo de la AT-riĉa regiono en dsDNA55,56.Tiu ligado igas la DNA fleksi aŭ rektiĝi, permesante al kanonikaj transkripcifaktoroj aliri ĝian konsentsekvencon.La C-fina vosto verŝajne estas implikita en protein-proteina interagoj kaj la rekrutado de transkripcifaktoroj, ĉar C-fina forigmutaciuloj estas nekapablaj iniciati transskribon57.Plie, ĉi tiu domajno enhavas plurajn konservitajn fosforilejojn kiuj estas konataj substratoj por kinazoj 58 .Ni observis HLA-A kaj H2B-interagojn kun HMGA1 ekster la C-fina domajno, sugestante, ke la C-fina domajno estas ĉefe uzata por transskriba faktoro-ligado (Fig. 5A, C).HMGA-proteinoj konkuras kun histono H1 pri ligado al adaptila DNA, tiel pliigante alireblecon57.Simile, ŝajnas verŝajne ke HMGA interagas kun histono H2B laŭ la ligilDNA en konkurado kun histono H1.HMGB1 induktas la esprimon de HLA-A, -B, kaj -C en dendritaj ĉeloj, kaŭzante ilian aktivigon59, sed interagado inter HMG kaj HLA ne estis antaŭe raportita.Ni trovis, ke HMGA1 interagas kun la α1 kaj α3-domajnoj de HLA-A, kun la plej multaj el la interagoj ekster ĝiaj 3 DBD (Figuro 5A, C).En niaj manoj, HLA-A estis trovita lokalizita en la nukleo (datenoj ne montritaj), kaj pro tio, ke H2B kaj HMGA1 ankaŭ ĉeestas en la nukleo, ĉi tiu interago verŝajne okazas en la nukleo.Specifaj aduktoj mezuritaj inter H2B, HLA-A kaj HMGA1 estas montritaj en Figuro 5D.
Plej multaj interagoj de HLA-A kun aliaj proteinoj okazas ene de ĝiaj α1 kaj α2-domajnoj kaj la senorda C-fina domajno (Fig. 6).En unu el ĉi tiuj ekzemploj, ni trovis, ke HLA-A interagas kun la senorda N-fina vosto de LRCH4 (Figuro 6A, D).LRCH4 reguligas TLR4-aktivigon kaj LPS-citokinindukton, tiel modulante la denaskan imunreagon60,61.Ĝi estas membranproteino kun naŭ leŭcin-riĉaj ripetoj (LRRs) kaj kalmodulin (CH) homologiomotivo en sia ektodomajno, sekvita per transmembrana domajno (TMD) 60 , 62 .CH-domajnoj estis raportitaj mediacii protein-proteinajn interagojn 60 .Peco de proksimume 300 aminoacidoj inter la LRR kaj CH-domajnoj estas relative alirebla sed malorda.Surbaze de la funkcio de senordaj regionoj kiel perantoj de protein-proteinaj retoj kaj vesikula transporto 63 , ni trovis, ke la plej multaj proteinaj interagoj okazas en senordaj regionoj.Interagoj kun MDN1 estis distribuitaj laŭlonge de la proteino, inkluzive de la LRR1, LRR6, CH-domajnoj kaj hazardaj regionoj, dum H2B ĉefe ligis al la CH-domajno (Fig. 6A, B).Precipe, neniu el la interagoj inkludis la TMJ, sugestante la specifecon de la CLMS-aliro (Figuro 6A, B).
MDN1 ankaŭ estis identigita kiel parto de la HLA-A proteinreto (Figuro 6A).Ĝi apartenas al la AAA-familio de proteinoj (ATPazoj asociitaj kun malsamaj agadoj).Tio estas la sama N-fina AAA-domajno kiu organizas en heksameran ringon kaj forigas la kunigfaktoron de la 60S 64 ribosoma subunuo.ŝajnas esti simila al dineino64,65,66.Krome, la Asp/Glu-riĉa regiono estas sekvata de la MIDAS-domajno (metaljondependa ejo).Pro la granda grandeco de MDN1 (ĉirkaŭ 5600 aminoacidoj) kaj ĝia limigita homologio kun bone studitaj proteinoj, malmulto estas konata ĉirkaŭ ĝia strukturo kaj funkcio en homoj.Ni identigis HLA-A, H2B kaj LRCH4 kiel MDN1-ligajn partnerojn kaj malkaŝis ilian orientiĝon kiel proteinaj kompleksoj en PyMol (Fig. 6A, B).Tiuj tri proteinoj interagas kun la AAA-domajno, la dinein-simila ligildomajno, kaj eventuale la MIDAS MDN1-domajno.En antaŭa raporto, afinecpurigo de logilproteinoj identigis MDN1 kiel proteinon asociitan kun histono H2B67.Krome, lastatempa studo ankaŭ raportis interagadon inter MDN kaj HLA-B en HCT116-ĉeloj uzante afinec-purigitan mas-spektrometrion, apogante niajn trovojn68.La identigo de tiu komplekso en IFNα-traktitaj provaĵoj indikas rolon por MDN1 en interferonsignalado.
Ĉar HLA-genoj estas tre polimorfaj, ni ĉerpis sekvencaj legas mapantaj HLA-A, -B, kaj -C de RNA-sekvencaj datumoj de Flo-1-ĉeloj (datenoj ne montritaj).Peptidsekvencoj kongruaj kun la sinsekva legado malkaŝis signifajn diferencojn inter HLA-A, -B, kaj -C en regionoj kie kruc-ligitaj peptidoj situis en HLA-A (Figuro S3).Krome, ni ne observis protein-al-protein-krucligadon de HLA-B/C molekuloj kun H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteinoj.Tio indikas ke la proteininteragado trovita inter HLA-A, MDN1, LRCH1 kaj HMGA1 estas HLA-A specifa.Krome, proteomia analizo de ne-krucigataj provaĵoj (Tablo S4) montris, ke HLA-A havas pli altan sekvenckovradon kompare kun HLA-B aŭ HLA-C.La peptidoj identigitaj por HLA-A estis altaj en intenseco en ambaŭ IFNα-traktitaj kaj netraktitaj provaĵoj.
Por certigi, ke la interagoj identigitaj ĉi tie ne ŝuldiĝis al nespecifa krucligo de du proteinoj en proksima spaca proksimeco, ni plue konfirmis du novajn HLA-A-interagajn faktorojn farante ko-imunoprecipitadajn provojn.HLA-A-interagoj kun endogenaj MDN1 kaj H2B estis detektitaj en kaj IFNα-traktataj kaj netraktitaj Flo-1-ĉeloj (Figuro 7, Figuro S4).Ni konfirmis, ke HLA-A estis kaptita de H2B en la imunoprecipitatoj kaj ke ĉi tiu asocio ŝuldiĝis al IFNα-traktado ĉar HLA-A forestis en la imunoprecipitaj specimenoj de netraktitaj ĉeloj (Figuro 7A).Tamen, niaj datumoj sugestas, ke IFNα diferencige reguligas HLA-A-ligadon al H2B kaj MDN1.IFNα stimulas asocion inter H2B kaj HLA-A, sed reduktas ĝian asocion kun MDN1.Ni trovis, ke MDN1 estis asociita kun HLA-A en kontroloj, kaj la aldono de IFNα reduktis ĉi tiun interagon sendepende de MDN1-indukto per IFNα (Figuro 7B, C).Krome, HLA-A imunoprecipitado kaptis H2B en A549-ĉeloj (Fig. S4), sugestante ke tiu interago estas sendependa de ĉeltipo.Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj subtenas interferon-mediaciitajn interagojn de HLA-A kun H2B kaj MDN1.
HLA-A kunpurigas H2B kaj MDN1.Reprezentaj endogenaj H2B (A) kaj MDN1 (B) imunblots estis imunoprecipititaj de IFNα-traktataj Flo-1-ĉeloj kaj sondis por la indikitaj antikorpoj.Muso kaj kuniklo IgG estis utiligitaj kiel negativa kontrolo.(C) Relativaj kvantoj (enigaĵo) de malsamaj antigenoj estas prezentitaj per imunblots sondita kontraŭ indikitaj antikorpoj, β-aktino estis uzata kiel ŝarĝa kontrolo.
La strukturaj trajtoj de unu el la interferon-induktitaj tre fidindaj kruc-ligitaj retoj, H2B-HLA-A-HMGA1, estis esploritaj.Ni uzis molekulan dinamikan modeladon kiel alternativan aliron por kompreni la konformigan dinamikon de la proteinoj implikitaj en ĉi tiu komplekso (Figuro 8).Inferencoj de la CLMS-datenoj indikas la eblecon de malsamaj formoj de la H2B, HLA-A, kaj HMGA1-proteinoj.Tial, la sekvaj eblaj kompleksoj estis modeligitaj en solventa medio: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, kaj H2B-HLA-A-HMGA1.Komenca protein-proteina aldokekrano uzanta la MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montrealo, Kebekio, Kanado) sugestis eblajn konformiĝojn kiuj malsamas inter ĉi tiuj proteinoj (Fig. 8A).Bildigo de la aldoka proteina komplekso malkaŝis plurajn interagojn kaj eblajn konformiĝojn (Figuro 5A, 8).Tiel, unu ebla formo estas montrita en Figuro 8A (kun etikeditaj krucligoj) kaj ĝi estis plue taksita uzante la MD-modeldukton.Krome, ligado de H2B aŭ HMGA1 al HLA-A elstarigas la pli altan afinecon de H2B por HLA-A (Fig. 8A).
Konforma dinamiko de eblaj retoj inter la H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, kaj H2B-HLA-A-HMGA1-kompleksoj.(A) Maldekstra panelo estas 2D mapo (generita en SIM-XL-programaro) de intramolekulaj (ruĝaj) kaj intermolekulaj (bluaj) krucligiloj (krucliga tranĉo agordita al 3.5).Krome, krucligaj restaĵoj identigitaj estas etikeditaj sur la strukturoj de la H2B, HLA-A, kaj HMGA1-proteinoj.La rilataj formoj de tiuj proteinoj estis ĉerpitaj uzante la aldokigan dukton efektivigitan en la MOE-pakaĵo.La malsupra maldekstra panelo montras la diversajn eblajn formojn de la H2B-HLA-A kaj HMGA1-HLA-A kompleksoj kun malsamaj protein-proteinaj ligaj afinecoj (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Norma devio (RMSD) de atompozicioj (ekskludante hidrogenatomojn) por ĉiu proteinstrukturo.(C) Intermolekulaj protein-proteinaj hidrogenaj ligaj interagoj de diversaj simulitaj kompleksoj konsiderante specifajn interagojn de daŭro ≥ 10 ns.La h-obliga distanco de donacanto-akceptanto estis agordita al 3.5 Å, kaj la donacanto-H-akceptanto detranĉa angulo estis fiksita al ≥ 160°–180°.(D) Etikeditaj restaĵoj formantaj HLA-A-protein-proteinajn interagojn kun siaj respektivaj partneroj, enhavantaj ≥ 20 ns, ĉerpitaj el imitaĵaj HLA-A-H2B kaj HLA-A-HMGA1-kompleksoj.Proteinstrukturoj reprezentas mezan strukturon de 100 ns MDS.(E) Interagoj inter HLA-A-H2B kaj HLA-A-HMGA1-kompleksoj kompare kun interagoj spuritaj per H2B-HLA-simulado pli ol 100 ns bazitaj sur la K aŭ S-interagadejo inter la du peptidoj.Kompleksoj /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.La sojla valoro por la taksado de kruc-ligoj estis fiksita al 3.0, kaj specifaj interagoj de MDS prenanta ≥ 10 ns estis konsiderataj.Proteinaj strukturoj estis bildigitaj uzante pakaĵojn de BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San-Diego, CA, Usono) kaj Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montrealo, Kebekio, Kanado).
La stabileco de HLA-A-molekuloj laŭlonge de la tempo (norma devio; RMSD aŭ norma devio; RMSF) indikis, ke la ĉeesto de H2B aŭ HMGA1-proteinoj en la kompleksoj stabiligis HLA-A (Figuro 8B, Figuro S5).La HMGA1-proteino ligas firme al la B2M-ejo de HLA-A, induktante la stabilecon de la HLA-A aminoacidoj en la HLA-A-HMGA1 aŭ H2B-HLA-A-HMGA1-komplekso (Figuro 8B, Figuro S5).aparte, HLA-restaĵoj ~60-90 kaj ~180-210 estis trovitaj esti malpli flekseblaj en la ĉeesto de H2B (FIG. 8B).H2B kaj HMGA1 montris pli bonan ligon al HLA-A en la komplekso H2B-HLA-A-HMGA1 kompare kun HLA-A ligado al H2B aŭ HMGA1 sole (Figuro 8C, D; Tabelo S5).Restaĵoj implikitaj en hidrogenligado (MD modeligis altan okupadon ≥ 10 ns) koincidas kun CLMS-interagejoj (K aŭ S-restaĵoj) en la komplekso, sugestante ke la interagoj identigitaj fare de CLMS estas tre fidindaj.Fidindeco (Fig. 8E).En CLMS kaj MD-modelado, HLA-A-restaĵoj inter proksimume 190-210 kaj proksimume 200-220 aminoacidoj estis trovitaj ligi H2B kaj HMGA1, respektive (FIG. 8E).
Protein-proteinaj interagoj formas dinamikajn strukturajn retojn kiuj mediacias intraĉelan komunikadon en respondo al certaj stimuloj.Ĉar multaj proteomikaj aliroj detektas ŝanĝojn en la totala stabilŝtatnivelo de proteino, protein-proteina interagaddinamiko postulas kromajn ilojn kapti devigajn interfacojn, kaj CLMS estas unu tia ilo.La interferona signalsistemo estas citokinreto kiu permesas al ĉeloj respondi al gamo da mediaj patogenaj kaj internaj patologiaj signaloj, kulminante per la indukto de subaroj de interferon-indukteblaj proteinoj.Ni aplikis CLMS por determini ĉu novaj protein-proteinaj interagoj povus esti identigitaj inter panelo de interferon-induktitaj proteinoj.Tutmonda protein-interliga analizo en interferon-respondema Flo-1-ĉelmodelo estis utiligita por kapti proteinkompleksojn.Eltiro de triptikaj peptidoj de ne-kruc-ligitaj kaj kruc-ligitaj ĉeloj permesas por peptidnombrado, padoriĉigo, kaj peptidlongodistribuo kun difinita LFQ-intenseco.Kanonikaj interferon-indukteblaj proteinoj estis identigitaj kiel pozitiva interna kontrolo, dum novaj intermolekulaj kaj intramolekulaj kruc-ligitaj aduktoj de kanonikaj interferon-indukteblaj proteinoj kiel ekzemple MX1, UP18, OAS3 kaj STAT1 estis observitaj.Diversaj strukturaj ecoj kaj interagoj en funkciaj areoj estis esploritaj.
Interagado inter HLA-A, MDN1 kaj H2B estis detektita per imunblotting en Flo-1 kaj A549-ĉeloj traktitaj kaj netraktitaj kun IFNα.Niaj rezultoj reliefigas, ke HLA-A kompleksiĝas kun H2B laŭ IFNα-dependa maniero.Nia laboro reprezentas interesan vojon por plia esplorado de la samlokigo de ĉi tiuj du kompleksoj.Estus ankaŭ interese vastigi la CLMS-aliron al panelo de ĉellinioj por identigi ĉel-tip-sendependajn interferon-mediaciitajn proteininteragojn.Fine, ni uzis MD-modeladon kiel alternativan aliron por kompreni la konformigan dinamikon de proteinoj implikitaj en la komplekso H2BFS-HLA-A-HMGA1, kiu spuris intramolekulajn kaj intermolekulajn interparoladojn.Inferencoj de la CLMS-datenoj indikas la eblecon de malsamaj formoj de la H2BFS, HLA-A, kaj HMGA1-proteinoj.La eblaj malsamaj formoj inter ĉi tiuj aldokaj proteinkompleksoj rivelis plurajn interagojn similajn al tiuj observitaj en la CLMS-datumaro.Unu el la ĉefaj fortoj de nia metodo estas, ke ĝi permesas facilan identigon de interagado de tre polimorfaj genoj kiel ekzemple HLA, do estos interese studi interagojn de HLA-haplotip-specifaj proteinoj kiuj alie malfacilas studi.Kunigitaj, niaj datumoj pruvas, ke CLMS povas esti uzata por vastigi nian komprenon pri signalretoj induktitaj de interferon kaj provizi bazon por studi pli kompleksajn interĉelajn sistemojn en la tumormikromedio.
Flo-1-ĉeloj estis akiritaj de ATCC kaj konservitaj en DMEM (Gibco) kompletigita kun 1% penicilino/streptomicino (Invitrogen), 10% feta bova serumo (Gibco) kaj stokitaj je 37 °C kaj 5% CO2.Kovado.Ĉeloj estis kreskigitaj al 70-80% kunfluejo antaŭ esti traktitaj kun IFNα14 (fabrikita fare de Edinburgh Protein Production Facility).Ĉiuj aliaj kemiaĵoj kaj reakciiloj estis aĉetitaj de Sigma Aldrich krom se alie notite.
Flo-1-ĉeloj estis kultivitaj en 6-putoj teleroj kaj la sekvan tagon la ĉeloj estis traktitaj kun 10 ng/ml IFNα14 dum 24 horoj ĝis proksimume 80% kunfluo.Ĉeloj estis lavitaj tri fojojn kun PBS kaj ligitaj kun ĵus preta DSS (Thermo Fisher Scientific) (solvita en DMSO) en PBS dum 5 minutoj je 37 ° C ĝis fina koncentriĝo de 0,5 mM.La DSS-kruciga reago estis anstataŭigita per PBS kaj resta DSS estis estingita aldonante 20 mM Tris (pH 8.0) en PBS dum 15 minutoj je 37 °C.Ĉeloj estis kolektitaj per skrapado kaj kolektitaj en malaltaj ligaj tuboj (Aksigeno).
La ĉela buleto estis lizita kun 300 µl da urea lizobufro (8 M ureo, 0,1 M Tris, pH 8,5) dum 30 minutoj ĉe ĉambra temperaturo kun foja skuado.Ĉiuj centrifugaj paŝoj estis faritaj je 14,000 xg je 8 °C.Centrifugu la lizaton dum 10 minutoj kaj translokigu la supernatanton al nova tubo.La ceteraj klaraj partikloj estis solvitaj en 150 μl de la dua liza bufro (2 M ureo, 2% (w/v) SDS (natria dodecilsulfato)) dum 30 minutoj aŭ pli ĝis homogena akva solvaĵo estis akirita.La lisato estis centrifugata dum 20 minutoj kaj la supernatante estis miksita kun la lisato akirita en la antaŭa paŝo.Proteinaj koncentriĝoj estis taksitaj uzante la Mikro-BCA-analizon (Thermo Fisher Scientific) laŭ la instrukcioj de la fabrikanto pri mikroplataj proceduroj.La specimenoj estis rapide frostigitaj en likva nitrogeno kaj konservitaj je -80 °C.
Proksimume 100 μg da solvebla kruc-ligita proteino estis prilaboritaj uzante modifitan filtran specimenan preparprotokolon (FASP) kiel priskribite de Wisniewski et al.69 Mallonge, la proteino estas krucligita kun 200 µl da ureobufro (8 M ureo en 0,1 M Tris, pH 8,5), vortexita kaj duonigita.Ĉiuj centrifugaj paŝoj estis faritaj je 14,000 xg je 25 °C.La unua duono de la kruc-ligita proteinlysate estis transdonita al 10 kDa Microcon centrifuga filtrila aparato ekipita per Ultracel-10-membrano (Merck), sekvita per centrifugado sur la filtrilo dum 25 minutoj.Poste aldonu la duan duonon de la proteino al la filtrilo kaj ripetu la samajn paŝojn.Proteina reakiro estis farita per aldonado de 100 μl da 17 mM tris(2-carboxyetil)fosfina klorhidrato (TCEP) en urea bufro.Reakiro estis movita sur termomiksilo je 600 rpm dum 30 minutoj je 37 °C.Krome, la kolono estis centrifugata kaj la reduktita kruc-ligita proteino estis alkilata uzante 100 μl de 50 mM jodoacetamide en urea bufro.La alkiliga reago estis efektivigita ĉe ĉambra temperaturo dum 20 minutoj en la mallumo.Rotu la kolonon, lavu la kolonajn murojn 3 fojojn per 100 µl de ureo-bufro, kaj poste centrifugu.La sama operacio estis farita 3 fojojn uzante 100 μl da 100 mM amonia bikarbonato.Antaŭ tripsinigo, anstataŭigu la kolektan tubon per nova.Aldonu digesta bufro enhavanta 50 mM amonia bikarbonato kaj 1 µl tripsino diluita en tripsina bufro (Promega).La proporcio de tripsino al proteino estis konservita je proksimume 1:33, kaj digestaj reagoj estis kovataj dum la nokto je 37° C. en humida ĉambro.La krucligita peptido estis eluita de la filtrilo per centrifugado dum 25 minutoj.Peptida reakiro estis plibonigita aldonante 50 μl de 0.5 M NaCl al la filtrilo, sekvita per centrifugado dum 25 minutoj.
C18 Micro Spin-kolumnoj (Harvard Apparatus) estis uzataj por sensaligi kruc-ligitajn triptikajn peptidojn sekvante la protokolon priskribitan de Bouchal et al.70 kun negravaj modifoj.Mallonge, C18-spinkolumnoj estis aktivigitaj kun tri lavoj de 0.1% formitacido (FA) en acetonitrilo (AcN) (Merck) kaj du lavoj de 0.1% FA.La kolono estis hidratigita kun 0.1% FA dum 15 minutoj.Ŝarĝu specimenojn en spinkolumnojn kaj lavu 3 fojojn kun 0,1% FA.La sensaligitaj peptidoj estis sinsekve eluitaj kun laŭpaŝa gradiento uzante 50%, 80% kaj 100% AcN en 0.1% FA.La specimenoj estis sekigitaj en SpeedVac Plus-koncentrilo (Eppendorf) ĝis la resta likvaĵo tute malaperis.La eluitaj peptidoj estis solvitaj en 100 μl de 0.08% trifluoraceta acido en 2.5% AcN kaj la koncentriĝoj estis mezuritaj sur NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Proksimume 1 μg da krucligita peptido per specimeno estis injektitaj en la LC-MS/MS-sistemon.
Kruc-ligitaj peptidoj estis apartigitaj sur UltiMate 3000 RSLCnano LC-sistemo (Thermo Scientific) ligita al Orbitrap Exploris 480 mas-spektrometro (Thermo Scientific).Kruc-ligitaj peptidoj estis kolektitaj sur 300 µm ID, 5 mm longa µ-antaŭ-kolumna C18-kapta kolono pakita kun C18 PepMap100-sorbento kaj 5 µm PepMap-sorbento (Thermo Scientific).Ŝarĝu la pumpilfluon fiksitan je 5 µl/min 0,08% trifluoraceta acido solvita en 2,5% AcN.Kruc-ligitaj peptidoj estis apartigitaj sur analiza kunfandita silika kolumno kun interna diametro de 75 μm kaj longo de 150 mm, plenigita per 2 μm PepMap-sorbento (Thermo Scientific).Movaj fazoj A kaj B konsistis el 0.1% FA el akvo kaj 0.1% FA el acetonitrilo, respektive.La gradiento komenciĝas ĉe 2.5% B kaj pliiĝas linie al 40% B dum 90 minutoj, tiam al 90% B dum la venontaj 2 minutoj.La movebla faza kunmetaĵo estis konservita ĉe 90% B dum 10 minutoj kaj poste malpliiĝis linie al 2.5% B dum 2 minutoj.La kolono estis ekvilibrigita je 2.5% B dum 8 minutoj antaŭ la sekva ciklo.Krucligitaj peptidoj ellasitaj de la analiza kolono estis jonigitaj en nanoelektrospray-jonigo (NSI) fonto kaj injektitaj en Exploris 480 mas-spektrometro (Thermo Scientific).
La mas-spektrometro Orbitrap Exploris 480 funkciis en la pozitiva datenkorelacia reĝimo.Plena skanado estis farita en sekcia reĝimo ĉe rezolucio de 120,000 kun intervalagordoj de m/z 350 Th ĝis m/z 2000 Th.La normaligita AGC-celo estis fiksita je 300% kun maksimuma enigtempo de 50ms.Monoizotopa pintdetekto estis establita por peptidoj.La lima malstreĉiĝo-parametro estas metita al vera se tro malmultaj antaŭuloj estas trovitaj.La minimuma jona forto de la antaŭulo estis fiksita al 5.0e3 kaj antaŭaj ŝargaj statoj ĝis +8 estis inkluditaj en la eksperimentoj.
La ciklotempo inter gravaj skanadoj en datumkorelacia reĝimo estis fiksita al 2.5 sekundoj.Dinamika amasekskludo estis fiksita al 20 s post la unua fragmentiĝo de la antaŭjono.La antaŭulo izolita fenestro estis fiksita al 2 Th.La speco de normaligita kolizioenergio kun fiksa kolizio-energioreĝimo estis elektita en datendependa MS/MS-skanado.Kolizioenergio starigita al 30%.La Orbitrap-rezolucio estis fiksita al 15,000 kaj la AGC-celo al 100%.La kutima maksimuma injektotempo estas fiksita al 60 milisekundoj.
Antaŭ spuri la protein-proteinan reton en kruc-ligitaj specimenoj, ni prilaboris la krudajn dosierojn uzante la MaxQuant-pakaĵon (versio 1.6.12.0)26,27 por identigi spureblajn peptidojn/proteinojn en la specimenoj.Krome, similaj proteomiaj analizoj estis faritaj sur nekrucigitaj Flo-1-provaĵoj traktitaj kaj netraktitaj kun IFNα.MS/MS-datumoj estis serĉitaj en la homa datumbazo UniProt (www.uniprot.org) (alŝutita la 12-an de aŭgusto 2020, enhavas 75,093 enskribojn) uzante la enkonstruitan serĉilon Andromeda27.La serĉo estis farita sen indiki la specifecon de la enzimo kaj diversaj modifoj de deamidation (N, Q) kaj oksigenado (M).Antaŭaj amastoleremoj estis fiksitaj je 20 ppm kaj produktaj jonoj je 0.02 Da.La komenca kaj maksimuma masodevio estis fiksita al 10 ppm.La maksimuma maso de la peptido estis fiksita ĉe 4600 Da kaj la sekvencosimileco estis metita inter 7 kaj 25 aminoacidoj (aa).Plia statistika analizo estis farita per la programo Perseo (versio 1.6.10.45).Proteinenhavo estis kalkulita per normaligo de la spektra intenseco de la proteino (LFQ-intenseco; senmarka kvantigo)27 kaj la intensecvaloroj estis konvertitaj al Log2.Hierarkia grupigo de proteinoj identigitaj per ilia peptida intenseco estis konstruita uzante la pheatmap (v1.0.12) pakaĵon en R (v 4.1.2).Voja riĉiga analizo estis farita uzante la Reactome-vojdatumbazon por IFNα-traktitaj proteinoj kiuj estis pli ol kvar fojojn aktivigitaj kompare al netraktitaj provaĵoj.
Identigo de specifaj kemiaj interligoj de lizino (K) aŭ serina (S) de proteinaj kompleksoj monitoritaj de LC-MS/MS estis farita per spektroskopa identiga maŝino (SIM-XL) por kruc-ligitaj peptidoj (SIM-XL)29.Unue, eblaj interagoj inter interferon-asociitaj (IFN) DNA-damaĝorezista subskribo (IRDS) genoj estis esploritaj uzante la IRDS-proteinan datumaron priskribitan en Padariya et al.28.Kribrado de ĉiuj kondiĉoj kaj ripetoj de la tuta homa UniProt estas komputile intensa, do la tuta homa UniProt-datumbazo (www.uniprot.org) (elŝutita la 12-an de aŭgusto 2020, enhavas 75,093 enskribojn) kontraŭ IFNα-traktitaj ripetoj.Unu el la filtriloj por altaj fidindaj interagoj.Ĉi tiuj alt-signifaj interagoj akiritaj estis vastigitaj kaj provitaj en ĉiuj ripetoj kaj kondiĉoj.
En SIM-XL, DSS estis uzita por la krucliga (XL) kaj la XL-pezŝanĝo kaj modifa pezoŝanĝo estis fiksitaj al 138.06 kaj 156.07, respektive.La sekvaj interligaj reagejoj estas konsiderataj: KK, KS kaj KN-TERM, sen raportaj jonoj.Kaj antaŭulo kaj fragmento ppm estis fiksitaj al 20 kaj la Xrea-sojlo estis fiksita al 0.15.Tripsino estis konsiderita kiel tute specifa, kaj alt-energia C-kaptilo (HCD) fragmentigmetodo estis efektivigita.La XCorr-dinamika DB-redukta sojlo kaj la minimuma nombro da peptidoj por dinamika DB-redukto estis fiksitaj al 2.5 kaj 2, respektive.Aliaj parametroj estas: monoizotopprobablo kaj pinta koincido-tranĉo, minimumo 4 AA-restaĵoj per fadeno kaj maksimuma fadenŝargo, kaj 3 maksimumoj de sopiritaj disiĝoj.La rezultaj kudritaj 2D mapoj estis analizitaj en (SIM-XL) kaj la grafika reprezentado xQuest28 estis uzata por konstrui la 2D-mapojn.Proteinkruciĝoj sur proteinstrukturoj estas disponigitaj en PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, versio 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteinmodelstrukturoj estis kreitaj uzante la Phyre2-servilon (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 uzante la principojn de homologiomodeligado kaj efektivigo de la "Hidden Markov Method".Phyre2 generas modelstrukturojn bazitajn sur sekvencparaleligo kun konataj proteinstrukturoj.Por H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, kaj MDN1 proteinoj, ŝablonstrukturoj 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, kaj 6i2665 estis uzitaj.Krome, la strukturo de AlphaFold71 MX1, UBP18 kaj ROBO1 ankaŭ estis konsiderita.La proteinstrukturo estis bildigita uzante la pakaĵon BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San-Diego, CA, Usono) kaj la pakaĵon Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montrealo, Kebekio, Kanado).