ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Dupleksa Veldita Tubo Por Kemia Industrio kemia komponanto, Manko de SPECC1L kondukas al pliigita stabileco de splisitaj juntoj kaj reduktita forigo de kraniaj neŭralaj krestaj ĉeloj.

Dankon pro vizito de Nature.com.Vi uzas retumilon kun limigita CSS-subteno.Por la plej bona sperto, ni rekomendas, ke vi uzu ĝisdatigitan retumilon (aŭ malŝaltu Kongruo-Reĝimon en Internet Explorer).Krome, por certigi daŭran subtenon, ni montras la retejon sen stiloj kaj JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Dupleksa Veldita Tubo Por Kemia Industrio

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.estas gvida fabrikisto, kiu estas specialigita pri senjuntaj tuboj de neoksidebla ŝtalo, brilaj kalitaj tuboj, senjuntaj volvitaj tuboj ktp.Por faciligi klientojn, ni ankaŭ veldis tubojn kaj tubojn.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.havas la plej altnivelajn produktajn kaj testajn ekipaĵojn.Ni povas plene kontentigi vian postulon.Laŭ normo tre strikte, tuboj produktataj de ni ĉiam havas ĝustan OD kaj WT-toleremon.La kontrolo de toleremo strikte konformas por produkti normojn.Niaj produktoj ĉiam estas kontentaj kun klientoj.Klientoj aĉetis niajn produktojn kreis pli da profitoj.
a) OD (Ekstera Diametro): 3.18mm ĝis 101.6mm
b) WT (Muro dikeco): 0.5mm ĝis 20mm
c) Longo: Laŭ la postulo de kliento
d) Normoj: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ktp
e) Proceza Metodo: ERW, EFW ktp

Glitiloj montrante tri artikolojn per diapozitivo.Uzu la malantaŭan kaj sekvan butonojn por moviĝi tra la lumbildoj, aŭ la butonojn de glit-regiloj ĉe la fino por moviĝi tra ĉiu lumbildo.
La kraniaj neŭralaj krestaj ĉeloj (CNCC) foriĝas de la embriaj neŭralaj faldoj kaj migras al la faringaj arkoj, kiuj formas la plej multajn el la mezvizaĝaj strukturoj.CNCC-misfunkcio ludas gravan rolon en la etiologio de orovizaĝa fendo, ofta denaska misformiĝo.Heterozigotaj SPECC1L-mutacioj estis trovitaj en pacientoj kun maltipaj kaj sindromaj fendetoj.Ĉi tie, ni raportas plifortigitan makuladon de kanonaj adhesivaj krucvojoj (AJ) komponentoj, β-catenin kaj E-cadherin en kulturitaj SPECC1L-frapaj ĉeloj, kaj elektronaj mikrografioj montras apika-bazan disvastigon de AJ.Por kompreni la rolon de SPECC1L en kraniovizaĝa morfogenezo, ni kreis Specc1l mankan musmodelon.Homozigotaj mutaciuloj estas embriaj mortigaj kaj elmontras difektitan neŭraltubfermon kaj CNCC-lamenigon.AJ-proteinmakulado estas pliigita en mutaciantaj neŭralaj faldoj.Tiu AJ-difekto estas kongrua kun difekto en CNCC-malaligo, postulante AJ-dissolvon.Krome, Specc11-mutaciuloj reduktis PI3K-AKT signaladon kaj pliigis apoptozon.En vitro, milda inhibicio de PI3K-AKT-signalado en sovaĝaj ĉeloj estis sufiĉa por indukti AJ ŝanĝojn.Grave, AJ-ŝanĝoj induktitaj per SPECC1L-knokaŭto povas esti inversigitaj per aktivigo de la PI3K-AKT-pado.Kunigitaj, ĉi tiuj datumoj sugestas, ke SPECC1L, kiel nova reguligisto de PI3K-AKT-signalado kaj AJ-biologio, estas postulata por fermo de neŭra tubo kaj CNCC-tavoliĝo.
Kraniaj neŭralaj krestoĉeloj (CNCCoj) lokalizas al la dorsa neŭroektodermo kaj dekroĉas de la neŭroepitelio de la evoluantaj neŭralaj faldoj tra procezo implikanta la epitel-mezenkiman transiron (EMT)1,2,3.Antaŭmigrantaj epiteliaj CNCCoj interrompas interĉelajn krucvojojn kaj iĝas migrantaj mezenkimaj CNCCoj kiuj plenigas la unuan kaj duan faringajn arkes kaj formas la plej grandan parton de la kraniovizaĝa kartilago.Tiel, genoj kiuj reguligas CNCC-funkcion ofte estas interrompitaj en la etiologio de kraniovizaĝaj denaskaj anomalioj kiel ekzemple orovizaĝaj fendoj, plej ofte influante 1/800 naskiĝojn en Usono sole.Unu el la denaskaj misformaĵoj8.
Delaminado de la CNCC koincidas kun la fermo de la antaŭa neŭra tubo inter 8.5 kaj 9.5 tagoj da embria evoluo en musoj.Mutaciuloj de kelkaj musaj orovizaĝaj fendet-rilataj genoj ankaŭ elmontras iun formon de neŭratubdifekto, inkluzive de Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, kaj Pdgfrα12.Tamen, la procezoj de neŭraltuba fermo kaj CNCC-tavoliĝo povas esti konsiderataj sendependaj, ĉar la Splotch-mutaciulo-muso (Pax3) elmontras difektojn en neŭraltuba fermo sen ajna efiko al CNCC-tavoliĝo aŭ migrado 13,14.Kromaj musmodeloj kun difektoj en CNCC-dissekcio kaj neŭraltuba fermo helpos kontuzi la komunan molekulan bazon de ĉi tiuj du procezoj.
Izoliĝo de CNCC de neŭroepiteliaj ĉeloj postulas la dissolvon de gluaj krucvojoj (AJs), kiuj estas kunmetitaj de proteinkompleksoj enhavantaj, inter aliaj, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, kaj α-aktinino asociita kun aktinaj filamentoj 2 Troesprimo-studoj E-cadherin en neŭralaj faldoj montris redukton aŭ malfruon en CNCC delaminado.Male, subpremado de E-kadherino rezultigas fruan tavoliĝon15,16.Multaj el la faktoroj kiuj mediacias EMT dum CNCC-tavoliĝo estas transkripcifaktoroj (AP2α, Id2, FOXD3, SAIL, TWIST, SOX10) kaj eksterĉela matrico (ECM) restrukturantaj proteinoj kiel ekzemple matricaj metaloproteinazoj (MMPoj), tamen CNCC estas rektaj citoskeletaj AJ reguligistoj estas. ankoraŭ ne konata.Oni scias, ke la PI3K-AKT-vojo kontraŭas E-kadherin-nivelojn, ĉefe de kanceresplorado17.Lastatempaj studoj montris, ke perdo de PDGFα-bazita PI3K-AKT signalado en musoj kondukas al kraniovizaĝaj anomalioj, inkluzive de fenda palato kaj neŭratubaj difektoj12.Tamen, la rilato inter la PI3K-AKT-pado kaj AJ-stabileco sur CNCC-tavoliĝo estas neklara.
Ni antaŭe identigis SPECC1L kiel la unua mutaciulgeno en du homoj kun severa fendo kiu etendiĝas de la buŝo ĝis la okulo, konata kiel oblikva fendo (ObFC) aŭ Tessier IV18 fendo.SPECC1L-mutacioj estis identigitaj en du plurgeneraciaj familioj kun la aŭtosoma domina Opitz G/BBB-sindromo (OMIM numero 145410), en kiu afektaj individuoj elmontris hiperdistancon kaj fendan lipon/palaton19, kaj en unu familio kun Tibi-trodistanca sindromo (OMIM numero 145420)20 .pli ol duono de kazoj de Opitz G/BBB-sindromo estas X-ligitaj (OMIM numero 300000) kaj estas kaŭzitaj de mutacioj en la MID1-geno, kiu ĉifras proteinon 22 el la mikrotubul-rilata ĉelskeleto.Ni hipotezas, ke SPECC1L, ankaŭ proteino asociita kun mikrotubetoj kaj la aktina citoskeleto, povas mediacii signaladon necesan por aktina citoskeleto restrukturado dum ĉela adhero kaj migrado 18 .Per studoj en vitro kaj en vivo, ni nun priskribas SPECC1L kiel novan reguliganton de AJ-stabileco per signalado de PI3K-AKT.Ĉe la ĉela nivelo, SPECC1L-manko rezultigis malkreskon en la nivelo de la pan-AKT-proteino kaj pliiĝon en la apika-baza disvastigo de AJ, kiu estis eliminita per kemia aktivigo de la AKT-pado.En vivo, Specc11-mankaj embrioj montras difektitan neŭraltubfermon kaj reduktitan CNCC-dissekcion.Tiel, SPECC1L funkcias en tre reguligita ĉela adher-bazita signalado postulata por normala CNCC-funkcio dum vizaĝmorfogenezo.
Por karakterizi la rolon de SPECC1L ĉe la ĉela nivelo, ni uzis la antaŭe priskribitan stabilan osteosarkoman ĉellinion U2OS mankantan en SPECC1L18.Ĉi tiuj stabilaj U2OS-ĉeloj kun SPECC1L (kd) knokaŭto havis moderan (60-70%) malkreskon en la niveloj de SPECC1L-transskribaĵoj kaj proteinoj, kune kun difektoj en migrado kaj reorganizo de la aktina citoskeleto 18. Kontraste, severa pasema malkresko en SPECC1L pruviĝis konduki al mitozaj difektoj 23 .Post plia karakterizado, ni trovis, ke niaj stabilaj SPECC1L-kd-ĉeloj ŝanĝis morfologion je tre alta grado de kunfluo (Figuro 1).Individuaj kontrolĉeloj kaj kd-ĉeloj ĉe malalta kunfluejo aspektis similaj (Figuro 1A, D).24 horojn post fandado, kontrolĉeloj konservis sian kuboidan formon (Fig. 1B, E), dum SPECC1L-kd-ĉeloj plilongigis (Fig. 1C, F).La amplekso de tiu ŝanĝo en ĉelformo estis kaptita per en viva viva bildigo de kontrolĉeloj kaj kd-ĉeloj (filmo 1).Por determini la rolon de SPECC1L en kunfluaj ĉeloj, ni unue ekzamenis ĝian esprimon.Ni trovis, ke SPECC1L-proteinniveloj pliiĝis post fuzio (Figuro 1G), dum SPECC1L-transskribaĵniveloj ne pliiĝis (Figuro 1H).Krome, kiel ĉela denseco pliiĝis, SPECC1L-proteino akumuliĝis ĉe interĉelaj limoj (Fig. 2A-E), kun ŝablono interkovranta kun tiu de membran-rilata β-catenino (Fig. 2A'-E').Konsiderante la asocion de SPECC1L kun la aktina citoskeleto 18,23 ni hipotezis, ke SPECC1L interagas kun aktin-bazitaj gluaj krucvojoj (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ĉeloj plilongiĝas ĉe alta kunfluejo (F) kompare kun kontrolo U2OS-ĉeloj (AC).Montritaj ĉi tie estas tri el la ses tempopunktoj (T1, T3, T6) kiujn ni elektis por malsamaj ĉelaj densecoj.(G) Analizo de okcidenta makulo montranta, ke la proteino SPECC1L estas stabiligita je alta grado da kunfluo kompare kun malalta grado da kunfluo en kontrolĉeloj.Okcidenta makulo de SPECC1L montras la atendatan 120 kDa-grupon kaj pli altan molekulpez-grupon, eventuale post-traduke modifitan (*).Western blot-analizo estis farita sub la samaj kondiĉoj por malalta kaj alta kunfluejo.Bildoj montrantaj SPECC1L ĉe malalta kaj alta kunfluejo estis prenitaj de la sama makulo.La sama makulo estis forigita kaj reekzamenita kun β-aktina antikorpo.(H) Kvanta RT-PCR-analizo montris neniujn signifajn ŝanĝojn en SPECC1L-transskribaj niveloj.Erarstangoj reprezentas SEMojn de kvar sendependaj eksperimentoj.
(AE) Ni elektis ses tempopunktojn (T1-T6) reprezentante gamon da ĉelaj densecoj por normaligi analizon de ĉelaj formoj kaj AJ ŝanĝojn en U2OS-ĉeloj kun SPECC1L-knockdown (kd).La unuaj kvin el tiuj tempopunktoj inkludis ununurajn ĉelojn (T1), 50-70% fuzion de malgrandaj ĉelaj aretoj (T2), fuzion sen transformi kd-ĉelojn (T3), transformi kd-ĉelojn (T4), kaj 24-horajn ŝanĝojn.en la malantaŭa formo de kd (T5) ĉeloj.La SPECC1L-proteino estis ĉefe disigita en la citoplasmo ĉe T1 (A), sed ĝia amasiĝo estis observita ĉe interĉelaj limoj ĉe postaj tempopunktoj (B-E, sagoj).(FJ) β-katenino montras similan amasiĝon ĉe interĉelaj limoj asociitaj kun la AJ-komplekso.(A'-E') SPECC1L kaj β-catenin montras imbrikan makuladon ĉe ĉellimoj ĉe alta ĉeldenseco (sagoj).(F'-J') En SPECC1L-kd ĉeloj, β-catenin-makulado prezentiĝas normala ĉe malalta ĉeldenseco (F'-H'), sed disetendiĝas kiam ĉelformoŝanĝoj (I', J'; sagoj), indikante ke AJ. ŝanĝiĝis.Strioj = 10 µm.
Ni tiam provis determini la efikon de SPECC1L-manko sur AJ.Ni uzis plurajn AJ-rilatajn markilojn, inkluzive de la kanonaj komponantoj F-aktino, miozino IIb, β-catenino kaj E-cadherin24,25,26,27.Aktinaj streĉaj fibroj pliiĝis en SPECC1L-kd-ĉeloj kiel priskribite antaŭe (Fig. 3A,B) 18 .Myosin IIb asociita kun aktinaj filamentoj montris similan pliiĝon en SPECC1L-kd-ĉeloj en vitro (Fig. 3C, D).AJ-asociita β-catenino ligas al kadherino ĉe la ĉela membrano, montrante normalan "kahelaron" esprimpadronon en kontrolkubocitoj (Fig. 3E, G).Kurioze, en plataj bildoj uzante konfokan mikroskopion, β-catenin (Fig. 3E, F) kaj E-cadherin (Fig. 3G, H) makulado sur la ĉela membrano de kunfluaj SPECC1L-mankaj ĉeloj montris elstarajn ŝablonojn de etendita makulado.Ĉi tiu ekspansio de β-katenina makulo en kd-ĉeloj estis plej prononcita ĉe kunfluejo, sed ŝajnis antaŭi ŝanĝojn en ĉelformo (Fig. 2F-J, F'-J').Por determini la fizikan naturon de ĉi tiu plilongigita AJ-makulado, ni ekzamenis ĉellimojn sur la apika-baza surfaco de SPECC1L-kd U2OS-ĉeloj per transdona elektrona mikroskopio (TEM) (Figuro 3I, J).Kontraste al kontrolĉeloj (Fig. 3I), kiuj havis apartajn elektrondensajn regionojn indikajn de AJ (sagoj), kd-ĉeloj (Fig. 3J) montris grandajn, apudajn regionojn de alta elektrona denseco indika de AJ laŭ la apikobaza ebeno..Krome, sur transversaj sekcioj, ni observis ampleksajn ĉelmembran faldojn en kd-ĉeloj (Fig. S1A, B), kio klarigas la plilongigitan ŝablonon de β-catenin kaj E-cadherin-makulaj bandoj (Fig. 3F, H).En subteno de la rolo de SPECC1L en AJs, β-catenin estis ko-immunoprecipitated kun SPECC1L en lisates de kunfluaj U2OS-ĉeloj (Fig. 3K).Kune kun etendita imunokolorigo por AJ-markoj, TEM-analizo estis kongrua kun nia hipotezo, ke SPECC1L-manko pliigas AJ-apika-bazan densecon kaj variancon.
(AH) Pliigita F-aktina makulo en kd-ĉeloj je 48 horoj post-fuzio (T6; A, B).Ŝanĝita makulado de miozino IIb asociita kun F-aktino (C, D).La glata ŝablono de β-catenin kaj E-cadherin-membranmakulado en kontrolĉeloj (E, G) estis plibonigita en SPECC1L-kd (F, H) ĉeloj.Strioj = 10 µm.(I-J) Elektronmikrografoj observante la apik-bazan interĉelan krucvojon.Kontrolĉeloj montras apartajn elektron-densajn regionojn indikante gluiĝemajn krucvojojn (I, sagoj).En kontrasto, la tuta apika-baza krucvojo en SPECC1L-kd-ĉeloj prezentiĝis elektrondensa (J, sagoj), indikante pliigitan densecon kaj disperson de gluaj krucvojoj.(K) β-catenino estis kunimunoprecipitita kun SPECC1L en kunfluaj U2OS-ĉelaj lisatoj.Bildo prenita de unu loko reprezentante unu el kvar sendependaj eksperimentoj.
Por kompreni la rolon de SPECC1L en kraniovizaĝa morfogenezo, ni kreis Specc1l mankan musmodelon uzante du sendependajn ES-kaptilajn ĉelliniojn, DTM096 kaj RRH048 (BayGenomics, CA), kiuj reprezentas intron 1 kaj Specc1l-transskribaĵoj estis kaptitaj ĉe 15 (Fig. 1) .4A, figuro S2).La genoma loko de la forlogaĵa vektora enigaĵo estis determinita per tuta genaro-sekvencado kaj konfirmita per PCR (Fig. S2).Ambaŭ genkaptildezajnoj ankaŭ permesis en-kadra fuzion de la Specc11-lacZ-raportistoj post kapto.Tial, lacZ-esprimo determinita per X-gal-makulado estis utiligita kiel indikilo de Specc11-esprimo.Ambaŭ aleloj montris similajn lacZ-esprimpadronojn, kun la DTM096-genkaptilo en introno 1 montranta pli fortan esprimon ol RRH048 en introno 15 (ne montrita).Tamen, Specc1l estas vaste esprimita, kun precipe forta esprimo en la neŭralaj faldoj ĉe E8.5 (Figuro 4B), en la neŭra tubo kaj vizaĝaj procezoj ĉe E9.5 kaj E10.5 (Figuro 4C, D), kaj en evoluaj membroj. ĉe E10.5 kaj okuloj (Figuro 4D).Ni antaŭe raportis, ke SPECC1L-esprimo en la unua faringa arko ĉe E10.5 ĉeestis en la epitelio kaj subesta mezenkimo18, kongrua kun la CNCC-genlinio.Por testi SPECC1L-esprimon en CNCC, ni faris E8.5-neŭrajn faldojn (Figuro 4E-J) kaj E9.5 kraniajn sekciojn (Figuro 4K-).Ĉe E8.5, SPECC1L intense makulis neŭrajn faldojn (Fig. 4E, H), inkluzive de ĉeloj makulitaj per NCC-markoj (Fig. 4G, J).Ĉe E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) forte makulita migranta CNCC kunmakula kun AP2A (Fig. 4L, M) aŭ SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Skema reprezentado de la musa Specc11 geno montranta forlogaĵvektoron enmeton en ES DTM096 (introno 1) kaj RRH048 (introno 15) ĉelklonoj.(BD) lacZ-makulado de heterozigotaj Specc1lDTM096-embrioj reprezentantaj Specc1l-esprimon de E8.5 ĝis E10.5.NE = neŭroektodermo, NF = neŭrala faldo, PA1 = unua faringa arko.(EP) SPECC1L imunokolorigo kun NCC-signoj AP2A kaj SOX10 en E8.5 (NF; EJ) neŭralaj faldoj kaj E9.5 (KP) kraniaj sekcioj.SPECC1L-makulado estis vaste observita en neŭralaj faldoj E8.5 (E, H; sagpintoj), inkluzive de ĉeloj etikeditaj kun AP2A (F, G; sagpintoj) kaj SOX10 (I, J; sagpintoj).Ĉe E9.5, SPECC1L forte makulis migrantajn CNCCojn (K, N; sagoj) etikeditaj AP2A (L, M; sagoj) kaj SOX10 (O, P; sagoj).
Kruciĝo inter heterozigotaj Specc1lDTM096/+ kaj Specc1lRRH048/+ musoj montras ke la du genkaptilaleloj ne estas komplementaj kaj ke kunmetitaj heterozigotoj kaj embriaj homozigotoj por ambaŭ genkaptilaleloj estas embriaj mortigaj (Tablo S1).Mendeliaj proporcioj indikis malkreskon en la postvivoprocento de heterozigotoj ĉe naskiĝo (atendita 1.34 kontraŭ 2.0).Ni rimarkis malaltan perinatan mortecon inter heterozigotoj, iuj havis kraniovizaĝajn anomaliojn (Fig. S3).Tamen, la malalta penetrance de tiuj perinataj kraniovizaĝaj fenotipoj malfaciligas studi iliajn subestajn patofiziologiajn mekanismojn.Tial ni koncentriĝis pri la embria mortiga fenotipo de homozigotaj Specc11-mutaciuloj.
La plej multaj kunmetitaj heterozigotaj aŭ homozigotaj Specc1lDTM096/RRH048 mutaciantaj embrioj ne disvolviĝis post E9.5–10.5 (Fig. 5A–D), kaj la neŭra tubo ne fermiĝis antaŭe (Fig. 5B, D) kaj foje fermiĝis malantaŭe (ne montrite) ..Ĉi tiu krania neŭraltuba fermdifekto estis asociita kun la plimulto de CNCC markita DLX2 restanta en la neŭralaj faldoj ĉe E10.5, indikante neniun dissekcion (Figuro 5A'-D').Por determini ĉu la ĝenerala grandeco de CNCC ankaŭ estis reduktita, ni etikedis CNCC-liniojn kun GFP en niaj genaj kaptillinioj kun Wnt1-Cre kaj ROSAmTmG.Ni fluas ordigitaj GFP+ NCC kaj GFP- (RFP+) ne-NCC el tutaj embrioj.Ĉe E9.5, la proporcio de fluo-sortitaj GFP-etikeditaj CNCC-oj ne ŝanĝiĝis signife inter WT kaj mutaciantaj embrioj (ne montritaj), indikante normalan CNCC-specifon.Tial ni hipotezis, ke postrestanta Wnt1-Cre kaj DLX2-makulado en elmontritaj neŭralaj faldoj (Figuro 5B') ŝuldiĝis al misa CNCC-tavoliĝo, eble pro pliigita denseco aŭ disvastigo de AJ-ĉeloj, kiel vidite en SPECC1L-kd-ĉeloj.Ni uzis la NCC-markojn SOX10, AP2A kaj DLX2 por konfirmi la ĉeeston de CNCC en la neŭrala faldo (Figuro 5E-R).Ĉe E8.5, neŭrala faldmakulado por ĉiuj tri NCC-markoj estis observita en sekcioj de WT (Fig. 5E, G, I) kaj Specc1l-mutaciulo (Fig. 5F, H, J).Ĉe E9.5, dum NCC-markoj makulis migrantan NCC en WT-sekcioj (Fig. 5M, O, Q), postrestanta NCC-makulado estis observita en elmontritaj neŭralaj faldoj de Specc1l mutaciantaj embrioj (Fig. 5N, P, R).Ĉar SOX10 kaj DLX2 markas migrantajn CNCCojn, tiu rezulto indikas ke SPECC1L-mankaj CNCC-oj realigu post-migrantan specifon sed malsukcesas migri de neŭralaj faldoj.
Specc11-manko kondukas al difekta neŭratubfermo, delaminado de kraniaj neŭralaj krestoĉeloj kaj AJoj.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrio portanta migrantajn kraniajn neŭrajn krestĉelojn (CNCC) etikeditajn kun Wnt1-Cre (A').En kontrasto, Specc11-mutaciulembrioj montras malfermajn neŭrajn faldojn (B), sagpintojn) kaj CNCCojn kiuj ne migris (B', sagpintoj).(C, D') Brilaj kampbildoj (C, D') kaj imunokolorigo (C', D') de la CNCC-signo DLX2 de E10.5 WT-embrioj (C, C') kaj Specc1l (D, D').En WT E10.5 embrioj, DLX2-pozitiva CNCC koloniigas la brankiarkojn (C', sagoj), dum ĉe mutaciuloj, okulfrapa makulo daŭras en la malfermaj neŭralaj faldoj (D', sagoj) kaj en la unuaj faringaj arkes (D', sagoj). sagoj).) kun iu makulo (sagoj) indikanta malbonan delaminadon kaj migradon de CNCC.ER) Sekcioj de WT kaj Specc1l mutaciantaj embrioj en stadioj E8.5 (E-L) kaj E9.5 (M-R) estis etikeditaj per NCC-signoj SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) kaj DLX2 (I, J, Q, R).Ĉe E8.5, NCC-makulado estis observita en sovaĝ-speca neŭrala faldo (NF) kaj mutaciulsekcioj.Kun-makulado de SOX10 kaj β-katenino en E8.5 WT (K) kaj mutaciulo (L) rivelis pliigitan β-katenin-makuladon ĉe ĉelaj limoj en la neŭralaj faldoj.Ĉe E9.5, sovaĝ-tipa makulo de migrantaj CNCC-oj (M, O, Q) estis observita, dum en mutaciuloj, nestratigitaj CNCC-oj makulis malfermajn neŭralajn faldojn (N, P, R).(S-Z) En vivo AJ-etikedadanalizo en koronaj sekcioj de WT kaj Specc11DTM096/RRH048-embrioj kun la E9.5-mutacio.Proksimuma sekca ebeno estas montrita en la supra dekstra angulo.En sekcioj de mutaciantaj histoj, pliigita makulo de F-aktino (S, T) kaj miozino IIb (U, V) estis observita.Simile al la en vitro rezultoj en Fig. 3, en mutaciantaj embrioj, plifortigita membranmakulado por β-catenino (W, X) kaj E-cadherin (Y, Z) estis observita.(AA-BB) Elektronmikrografo de sekcio de sovaĝ-speca embrio rigardanta preter la limo de la apik-baza ĉelo montras klaran elektron-densan regionon indikan de gluaj krucvojoj (AA, sagoj).En kontrasto, en sekcioj de Specc11 mutaciulembrioj (BB, sagoj), la tuta apikobaza krucvojo estas elektrondensa, indikante pliigitan densecon kaj disperson de gluaj krucvojoj.
Por testi nian hipotezon, ke reduktita tavoliĝo ŝuldiĝas al ŝanĝita AJ, ni ekzamenis AJ-etikedadon en elmontritaj neŭralaj faldoj de Specc1l mutaciantaj embrioj (Fig. 5S-Z).Ni observis pliiĝon en aktinaj streĉaj fibroj (Fig. 5S, T) kaj samtempa pliigita lokalizo de miosina IIB-makulado sur aktinaj fibroj (Fig. 5U, V).Grave, ni observis pliigitan makuladon de β-catenino (Fig. 5W, X) kaj E-cadherin (Fig. 5Y, Z) ĉe interĉelaj limoj.Ni ankaŭ ekzamenis β-catenin-makuladon de NCC en la neŭralaj faldoj de E8.5-embrioj (Fig. 5K, L).β-catenin-makulado ŝajnis esti pli forta en Specc1l mutaciantaj neŭralaj faldoj (Fig. 5L kaj K), sugestante ke AJ ŝanĝoj komenciĝis.En elektronaj mikrografioj de kraniaj sekcioj de E9.5-embrioj, ni denove observis pliigitan disvastigan elektron-densan makuladon en Specc1l mutaciantaj embrioj kompare kun WT (Fig. 5AA, BB kaj S1E-H).Kunigitaj, ĉi tiuj rezultoj subtenas niajn en vitro-rezultojn en SPECC1L-kd U2OS-ĉeloj kaj sugestas, ke aberra AJ-makulado antaŭas CNCC-tavoliĝon en niaj mutaciantaj embrioj.
Konsiderante la konatan antagonisman rilaton inter AKT-agado kaj E-kadherina stabileco,17,28 ni hipotezis la implikiĝon de PI3K-AKT-signalado.Krome, ni observis subepiderman blistering en kelkaj el niaj mutaciantaj embrioj kiuj eskapis letalecon (<5%) ĉe E9.5-10.5 kaj anstataŭe ekloĝis ĉe ĉirkaŭ E13.5 (Fig. S3).Subepidermaj vezikoj estas markostampo de reduktita PI3K-AKT-signalado bazita sur PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) raportis ke interrompo de PDGFRα-bazita PI3K-aktivigo en PdgfraPI3K/PI3K-mutaciulembrioj rezultigas subepidermajn vezikojn, neŭraltubdifektojn, kaj fenopalatfenotipojn.Efektive, niveloj de pan-AKT kaj aktiva fosforilata Ser473-AKT estis reduktitaj en vivo en Specc1l mutaciantaj histoj al E9.5 embria aresto (Fig. 6A-D).La malkresko en niveloj de fosforilata Ser473-AKT povas esti tute pro la malkresko en niveloj de pan-AKT en vivo (FIG. 6E) kaj in vitro (FIG. 6F).En vitro-malkresko estis observita nur kiam U2OS-ĉeloj forte kunfluis kun ŝanĝoj en ĉelformo kaj AJ-denseco (Figuro 6D).Tiel, niaj datumoj indikas, ke SPECC1L estas nova pozitiva reguligisto de PI3K-AKT-signalado en kraniovizaĝa morfogenezo.
(A-E) E8.5 (A,B) kaj E9.5 (C,D) kraniosekcioj aŭ E9.5 lisatoj de Specc1l-mutaciulembrioj (E) montrantaj nivelojn de aktiva fosforiligita S473-AKT kaj pan-AKT Proteinredukto , kompare kun kontrolo WT.Okcidenta makulado estis farita sur sovaĝ-specaj lisatoj kaj mutaciuloj sub la samaj kondiĉoj.La bildoj montritaj por SPECC1L estis prenitaj de unu makulo.La sama makulo estis forigita kaj reekzamenita kun kontraŭ-pan-ACT kaj β-aktina antikorpoj.Pan-AKT-niveloj en E8.5-neŭralaj faldoj (A, B) kaj niveloj de fosforilata S473-AKT en E9.5-kraniosekcioj estis signife reduktitaj.(F) Pan-AKT-niveloj estis simile reduktitaj en lisatoj de SPECC1L-kd U2OS-ĉeloj rikoltitaj ĉe alta kunfluejo.Erarstangoj reprezentas SEMojn de tri sendependaj Western blot-kvantigoj.(GJ) Sekcioj de WT-embrioj ĉe E9.5 makulitaj kun KI67 kaj fendita kaspase 3, respektive, montrante ĉelan proliferadon (G, G') kaj malmulte da apoptota agado (H, H').Specc11-mutaciulembrioj montras kompareblan ĉelmultobliĝon (I), sed la nombro da ĉeloj spertantaj apoptozon estas signife pliigita (J).
Ni tiam ekzamenis signojn de proliferado kaj apoptozo.Ni ne observis ajnan diferencon en la proliferado de E9.5-embrioj (Fig. 6E, G kompare kun I) kun prolifera indekso de 82.5% por WT-mutaciuloj kaj 86.5% por Specc1l-mutaciuloj mezuritaj per KI67-makulado (p <0.56, Fisher's). preciza testo).Simile, ni ne observis ajnan diferencon en apoptozo mezurita per makulado por fendita caspase 3 en neŭralaj faldoj ĉe E8.5 ĝis embria aresto (ne montrita) (ne montrita).En kontrasto, apoptozo estis signife pliigita en ĉiuj E9.5 mutaciantaj embrioj (Fig. 6F, H kaj J).Ĉi tiu ĝenerala pliiĝo en apoptozo kongruas kun reduktita signalado de PI3K-AKT kaj frua embria letaleco29,30,31.
Poste, por konfirmi kaŭzan rolon por signalado de PI3K-AKT en AJ ŝanĝoj en niaj kd-ĉeloj, ni kemie ŝanĝis la vojon en kontrolo kaj kd-ĉeloj (Figuro 7A-F).Ni uzis kiel markilon la ĉelformŝanĝfenotipon observitan en kunfluaj SPECC1L-kd-ĉeloj, kiujn ni kvantigis uzante la rilatumon de la plej longa dimensio (longo) al la responda vertikala dimensio (larĝo).Rilatumo de 1 estas atendita por relative rondaj aŭ kubaj ĉeloj (Figuro 7G).Krom ĉela formo, ni ankaŭ konfirmis la efikon al AJ per β-catenina makulo (Fig. 7A'-F').Inhibicio de la PI3K-AKT-pado uzante wortmanin estis sufiĉa por ŝanĝi ĉelformon en kontrolĉeloj (Figuro 7A, C) kaj AJ (Figuro 7A').PI3K-AKT-aktiviganto SC-79 ne influis ĉelformon (FIG. 7A, E) aŭ AJ-vastiĝon (FIG. 7A') en kontrolĉeloj.En SPECC1L-kd-ĉeloj, plia subpremado de la PI3K-AKT-vojo rezultigis pliigitan apoptozon (Fig. 7B, D) kaj konsiderindan pliiĝon en β-catenina makulo (Fig. 7B'), kongrua kun niaj en vivo pezaj mutaciuloj.Grave, aktivigo de la PI3K-AKT-vojo signife plibonigis ĉelformon (Figuro 7B, F) kaj AJ-fenotipojn (Figuro 7B").Ŝanĝoj en ĉelformo estis kvantigitaj kiel ĉela rondecproporcio (CCR) kaj komparitaj por signifo kiel priskribite supre (FIG. 7G).Efektive, en kontrolĉeloj (Fig. 7G, CCR = 1.56), wortmannin-traktado estis sufiĉa por signife ŝanĝi la ĉelan formon (Fig. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) ĝis la mezuro simila al tiu observita. en SPECC1L.-kd ĉeloj (Fig. 7G, CCR = 3.46).Wortmannin-traktado de SPECC1L-kd-ĉeloj (Fig. 7G, CCR = 3.60, neglektebla) estis ne pli signifa ol netraktitaj kd-ĉeloj (Fig. 7G, CCR = 3.46, neglekteblaj) aŭ wortmannin-traktitaj kontrolĉeloj (Fig. 7G)., CCR = 3.46, nekonsiderinda) aldone influas ĉelan plilongigon (7G, CCR = 3.61, nekonsiderinda).Plej grave, SC-79 AKT-aktiviganto restarigis la longforman fenotipon de SPECC1L-kd-ĉeloj (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Ĉi tiuj rezultoj konfirmas, ke SPECC1L reguligas PI3K-AKT signaladon kaj sugestas, ke modera malkresko en SPECC1L influas ĉelan adheron, dum forta malkresko kondukas al apoptozo (Fig. 8).
(A-F') Kontrolo (A, C, E) kaj SPECC1L-kd (B, D, F) ĉeloj traktitaj kun PI3K-AKT-vojinhibitoro wortmannin (C, D) aŭ SC-79-aktiviganto (E, F) Traktado .Netraktitaj kontrolĉeloj estas kuboidaj (A) kun normala β-kata ĉela makulado (A'), dum kd-ĉeloj estas longformaj (B) kun pliigita β-kata makulo (B').Post subpremado de la PI3K-AKT-pado, kontrolĉeloj plilongigis (C) kun β-kata ekspansio (C'), dum kd-ĉeloj komencis sperti apoptozon (D), simile al niaj tre mutaciitaj embrioj kaj montrante ekstreme plifortigitan β-katon.makulado (D').Post aktivigo de la PI3K-AKT-pado, kontrolĉeloj restis kubaj (E) kaj havis normalan β-katon (E') makuladon, dum kd-ĉeloj montris signife plibonigitan ĉelformon (F) kaj β-katon (F') makuladon, indikante. (G) La grado de ĉela formoŝanĝo en (AF) estis kvantigita uzante la ĉelan rondecproporcion (CCR) de la plej longa dimensio (longo) kaj la responda vertikala dimensio (larĝo) uzante MetaMorph-programaron.Netraktitaj (NT) SPECC1L-kd-ĉeloj (CCR = 3.46) estis signife pli longaj ol kontrolĉeloj (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).La inhibicio de Wort de la PI3K-AKT-pado en kontrolĉeloj estis sufiĉa kaŭzi similan plilongiĝon en ĉelformo (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Simile, AKT-aktivigo de SC-79 en SPECC1L-kd-ĉeloj restarigis ĉelan plilongiĝon al kontrolniveloj (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Wortmannin-traktado de SPECC1L-kd-ĉeloj rezultigis pliigitan apoptozon sed neniu plia kresko en ĉelformŝanĝo (CCR=3.60) kompare al netraktitaj kd (CCR=3.46, ns) aŭ wortmann-traktitaj kontroloĉeloj (3.61) observitaj en.ns = ne gravas.+/- SEM-mezuradoj por 50 ĉeloj estas montritaj.Statistikaj diferencoj estis kalkulitaj uzante la t-teston de Studento.
(A) Skema reprezentado de inhibicio kaj aktivigo de la PI3K-AKT-vojo rezultiganta AJ ŝanĝojn kaj savon, respektive.(B) Proponita modelo por AKT-proteina stabiligo de SPECC1L.
Antaŭmigrantaj CNCCoj postulas AJ-lizon apartigi de antaŭaj neŭralaj faldaj neŭroepiteliaj ĉeloj1,15,32.Pliigita makulado de AJ-komponentoj kaj perdo de la apkika-baza AJ nesimetria distribuo en SPECC1L-mankaj ĉeloj kaj en vitro kaj en vivo, kombinita kun la fizika proksimeco de SPECC1L al β-catenin, sugestas ke SPECC1L funkcias por konvene konservi AJ lokan stabilecon por organizaj muskoloj.aktina citoskeleto.La asocio de SPECC1L kun la aktina citoskeleto kaj β-catenino kaj la pliiĝo en la nombro da densigitaj aktinaj filamentoj en foresto de SPECC1L kongruas kun la observita pliiĝo en AJ-denseco.Alia ebleco estas ke pliigita nombro da aktinfibroj en SPECC1L-mankaj ĉeloj kondukas al ŝanĝo en interĉela streĉiteco.Ĉar ĉela streso influas AJ 33 dinamikon, tensioŝanĝoj povas rezultigi pli difuzan AJ 34 .Do ajnaj ŝanĝoj influos la CNCC-tavolojn.
Wnt1 estas esprimita en la fruaj neŭralaj faldoj kiuj kaŭzas neŭralajn krestajn ĉelojn.Tiel, Wnt1-cre genlinia spurado markas kaj antaŭ- kaj migrantan NCC35.Tamen, Wnt1 ankaŭ markas dorsajn cerbajn histajn klonojn ankaŭ derivitajn de fruaj neŭralaj faldoj 35,36, kio faras verŝajne ke nia makulado de E9.5-mutaciuloj por Wnt1-signoj en malfermaj neŭralaj faldoj ne estas CNCC.Nia pozitiva makulado por la NCC-markoj AP2A kaj SOX10 konfirmis, ke la elmontritaj neŭralaj faldoj de Specc11-mutaciulembrioj ja enhavis CNCC.Krome, ĉar AP2A kaj SOX10 estas signoj de frua migranta NCC, pozitiva makulo indikis, ke ĉi tiuj ĉeloj estas postmigrantaj CNCC, kiuj ne povas esti tavoligitaj per E9.5.
Niaj datumoj sugestas, ke molekula reguligo de AJ de SPECC1L estas mediata de PI3K-AKT-signalado.AKT-signalado estas reduktita en SPECC1L mankhavaj ĉeloj kaj histoj.Trovoj de Fantauzzo et al.subtenu rektan rolon por PI3K-AKT-signalado en kraniovizaĝa morfogenezo.(2014) montris ke la manko de aktivigo de PDGFRα-bazita PI3K-AKT signalado kondukas al fenopalatofenotipo.Ni ankaŭ montras, ke inhibicio de la PI3K-AKT-vojo sufiĉas por ŝanĝi AJ kaj ĉelformon en U2OS-ĉeloj.Konsekvence kun niaj trovoj, Cain et al.37 montris, ke subreguligo de la PI3K α110-subunuo en endoteliaj ĉeloj rezultigas similan pliiĝon en periĉela β-catenin-makulado, nomata kiel pliiĝo en la "konekteca indekso".Tamen, en endoteliaj ĉeloj kies aktinfilamentoj jam estas tre organizitaj, subpremado de la PI3K-AKT-pado rezultigas lozan ĉelformon.En kontrasto, SPECC1L-kd U2OS-ĉeloj montris longforman ĉelformon.Ĉi tiu diferenco povas esti specifa ĉela tipo.Dum subpremado de PI3K-AKT-signalado konstante influas la aktinan citoskeleton, la efiko al ĉelformo estas determinita per ŝanĝoj en streĉiĝo kaŭzitaj de ŝanĝoj en la denseco kaj organizo de centraj aktinfibroj.En U2OS-ĉeloj, ni uzis nur ĉelformŝanĝojn kiel markilon de SPECC1L-manka AJ ŝanĝo kaj reakiro.Konklude, ni hipotezas, ke inhibicio de la AKT-vojo en SPECC1L-manko pliigas AJ-stabilecon kaj reduktas delaminadon en CNCC.
Interese, pan-AKT-niveloj estis reduktitaj en vitro kaj en vivo krom fosforilitaj 473-AKT-niveloj en foresto de SPECC1L, sugestante reguligon de PI3K-AKT-signalado ĉe la nivelo de AKT-proteina stabileco aŭ spezo.La SPECC1L kaj MID1-genoj, ambaŭ asociitaj kun Opitz/GBBB-sindromo, ĉifras proteinojn kiuj stabiligas mikrotubulojn 18,22.La mekanismo de kiu SPECC1L kaj MID1 mediacias mikrotubulstabiligon ne estas plene komprenita.En la kazo de SPECC1L, ĉi tiu stabiligo inkluzivas plifortigitan acetiladon de subaro de mikrotuboj 18 .Estas eble ke SPECC1L uzas similan mekanismon stabiligi aliajn proteinojn kiel ekzemple AKT.Estis montrite ke acetiligo de lizinrestaĵoj en la AKT-proteino kondukas al malkresko en membranloko kaj fosforiligo38.Krome, ubikvitino de la K63-ĉeno ĉe la sama lizinrestaĵo sur AKT estas postulata por ĝia membranlokigo kaj aktivigo39,40.Inter pluraj faktoroj interagantaj kun SPECC1L-proteinoj identigitaj en diversaj altproduktaj gistaj du-hibridaj ekranoj, kvar - CCDC841, ECM2942, APC kaj UBE2I43 - estis implikitaj en proteinspezo aŭ stabileco per ubikvitino aŭ sumoilation.SPECC1L povas esti implikita en post-traduka modifo de AKT-lizinrestaĵoj, influante AKT-stabilecon.Tamen, la kritika rolo de SPECC1L en la lokalizo kaj stabileco de la AKT-proteino restas klarigenda.
Severaj difektoj en SPECC1L-esprimo en vivo rezultigis pliigitan AJ-signon-makuladon kaj difektan CNCC-kovraĵon, same kiel pliigitan apoptozon kaj fruan embrian letalecon.Antaŭaj raportoj montris, ke musmutaciuloj kun pliigitaj niveloj de apoptozo estas rilataj al neŭraltubaj difektoj 44,45,46,47 kaj kraniovizaĝaj difektoj48.Estis sugestite ke troa ĉelmorto en la neŭralaj faldoj aŭ faringaj arkoj povas rezultigi nesufiĉan nombron da ĉeloj necesaj por bonorda morfogenetika movado 48,49,50.En kontrasto, niaj mankhavaj ĉellinioj de SPECC1L kun modere reduktita SPECC1L-esprimo montris nur AJ ŝanĝojn sen signoj de pliigita ĉelmorto.Tamen, kemia inhibicio de la PI3K-AKT-pado en tiuj Kd-ĉeloj rezultigis pliigitan apoptozon.Tiel, modera malkresko en SPECC1L-esprimo aŭ funkcio certigas ĉelsupervivon.Tio estas kongrua kun la observado ke maloftaj Specc11-mutaciulembrioj kiuj evitas areston ĉe st.E9.5-eble pro reduktita gena kapta efikeco-povas fermi siajn neŭrajn tubojn kaj halti poste en evoluo, ofte kun kraniovizaĝaj difektoj (Fig. S3).Ankaŭ kongrua kun tio estas la malofta okazo de heterozigotaj Specc1l-embrioj kun kraniovizaĝaj anomalioj - verŝajne pro pliigita gena kapta efikeco - same kiel la trovo en zebrofiŝo en kiu unu el la du SPECC1L-ortologoj (specc1lb) kaŭzas malfruajn embriajn fenotipojn, inkluzive de perdo de. malsupraj makzeloj kaj duflankaj fendoj51.Tiel, heterozigotaj SPECC1L-perdo-de-funkciaj mutacioj identigitaj en homaj pacientoj povas kaŭzi malgrandajn kripliĝojn en SPECC1L-funkcio dum kraniovizaĝa morfogenezo, sufiĉa klarigi iliajn orovizaĝajn fendojn.SPECC1L-bazita reguligo de interĉelaj kontaktoj ankaŭ povas ludi rolon en palatogenezo kaj fuzio de la faringaj arkoj.Pliaj studoj pri SPECC1L-funkcio helpos pliklarigi la rolon de provizoraj interĉelaj kontaktoj en CNCC dum neŭratubfermo en neŭroepitelia ĉelmotileco kaj kraniovizaĝa morfogenezo.
U2OS-osteosarkoma kontrolo kaj SPECC1L-kd-ĉeloj estis priskribitaj antaŭe (Saadi et al., 2011).Antikorpoj kontraŭ SPECC1L ankaŭ estis karakterizitaj antaŭe (Saadi et al., 2011).Kontraŭ-β-cateninantikorpoj (kuniklo; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, Tx) (muso; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozino IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. ) , MO) ), E-kadherino (1:1000; Abkam, Kembriĝo, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Kolo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San-Diego). , Kalifornio), DLX2 (1:1000; Abcam, Kembriĝo, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), fendita caspazo 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) kaj β-aktino (1:2500; Sigma-Aldrich, St. MO ) estis uzata kiel priskribite..Aktinfilamentoj estis makulitaj per Acti-makulo-rodaminfaloidino (Citoskeleto, Denvero, Kolorado).
U2OS-kontrolĉeloj kaj SPECC1L-kd-ĉeloj estis kultivitaj en norma alta glukozo DMEM kompletigita kun 10% feta bova serumo (Life Technologies, Carlsbad, CA).Por AJ ŝanĝoj, 2 x 105 ĉeloj estis semitaj sur vitro traktita kun 0.1% porka gelateno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kaj observitaj por ŝanĝoj en ĉelformo.Ĉeloj estis kolektitaj en malsamaj indikitaj tempopunktoj: 4 horojn post semado (t = 1), 24 horojn post semado (t = 2), kunfluo sen ŝanĝo en ĉelformo (t = 3), ŝanĝo en ĉelformo (t = 4) , 24 h post ĉelformŝanĝo (t = 5) kaj 48 h post ĉelformŝanĝo (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Por moduli la PI3K-AKT-padon, ĉeloj estis kultivitaj ĉe la indikitaj koncentriĝoj kun la PI3K-AKT-inhibitoro wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minesoto) aŭ SC-79-aktiviganto (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minesoto).La medio enhavanta la kemiaĵojn estis ŝanĝita ĉiutage.
Kadro-post-kadra registradoj estis faritaj sur viva kontrolo kaj KD-ĉeloj sub normalaj kulturkondiĉoj, kaj fazaj kontrastaj bildoj estis kolektitaj ĉiujn 10 minutojn dum 7 tagoj.Bildoj estis akiritaj per komputila kontrolita Leica DM IRB inversa mikroskopo ekipita per mekanika stadio kaj 10 × N-PLAN-celo konektita al QImaging Retiga-SRV-fotilo.Dum bildigo, ĉelkulturoj estis konservitaj je 37 °C en humida atmosfero kun 5% CO2.
Du genkaptilaj ES-ĉellinioj DTM096 kaj RRH048 de la Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) estis uzataj por generi Specc11-mankatajn musliniojn, nomitajn Specc1lgtDTM096 kaj Specc1lgtRRH046.Mallonge, 129/REJ ES-ĉeloj estis injektitaj en C57BL6-blastocistoj.La rezultaj ĥimeraj masklaj musoj estis breditaj kun inaj C57BL6 musoj por identigi idojn kun agouti-mantelokolorigo.La ĉeesto de genkaptilaj vektoraj enigaĵoj estis uzata por identigi heterozigotojn.Musoj estis konservitaj sur miksita fono de 129/REJ;C57BL6.La loko de la enmeta loko de la genetika kaptilo-vektoro estis konfirmita per RT-PCR, genomsekvencado kaj genetika kompletigo (Kuldona Figuro 1).Por spuri la CNCC-genlinion de duoblaj heterozigotaj Specc1lGT-musoj, ROSAmTmG (numero 007576) kaj Wnt1-Cre (numero 003829) musoj (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) estis krucitaj por produkti la ROSAmTmG kaj Wnt1-Cre-alelon en Speccryos-mutaciulo.Ĉiuj eksperimentoj en musoj estis faritaj laŭ protokoloj aprobitaj de la Institucia Besto-Prizorgo kaj Uzo-Komitato de la Universitato de Kansasa Medicina Centro.
Embrioj estis fiksitaj en (1% formaldehido, 0.2% glutaraldehido, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) dum 60 min ĉe ĉambra temperaturo.Post fiksado en X-gal-makula solvaĵo (5 mM kalia ferricianido, 5 mM kalia ferocianido, 2 mM MgCl2, 0,01% natria deoksikolato, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Makulo-disvolviĝo estis farita je 37 °C. .°C ene de 1-6 horoj.Embrioj estis postfiksitaj en 4% PFA kaj bildigitaj.
Por Western blotting, ĉeloj estis lizitaj en pasiva lizobufro (Promega, Fitchburg, WI) kompletigita kun miksaĵo de HALT-proteazo-inhibitoroj (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates estis prilaboritaj sur 12% poliakrilamida Mini-PROTEAN TGX pretaj ĝeloj (Bio-Rad, Hercules, CA) kaj transdonitaj al Immobilon PVDF-membranoj (EMD Millipore, Billerica, MA).La membranoj estis blokitaj en 5% lakto en PBS enhavanta 0.1% Tween.Antikorpoj estis kovataj dum la nokto je 4 °C aŭ dum unu horo ĉe ĉambra temperaturo.Femto SuperSignal West ECL-reakciilo (Thermo Scientific, Waltham, MA) estis uzita por signalgenerado.Por imunokolorigo, embrioj estis fiksitaj dum la nokto en 4% PFA/PBS kaj kriokonservitaj.Histokrioseekcioj estis blokitaj en PBS enhavanta 1% normalan kapran serumon (Thermo Scientific, Waltham, MA) kaj 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) kaj poste kovitaj je 4 °C en inkubatoro dum la nokto.kun kontraŭ-antikorpo kaj fluoreska sekundara antikorpo (1:1000) dum 1 horo je 4 °C.Makulitaj sekcioj estis metitaj en ProLong-ormedion (Thermo Scientific, Waltham MA) kaj plataj bildoj estis akiritaj per Leica TCS SPE-konfoka mikroskopo.Ĉiu imunokolorigo estis farita kiel tri sendependaj eksperimentoj sur cirossekcioj de almenaŭ du mutaciantaj embrioj.Reprezenta eksperimento estas montrita.
Ĉeloj estis kovataj en modifita RIPA-bufro (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glicerolo, 2 mM EDTA, kaj HALT-proteazo-inhibitoro (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Mallonge, lisatoj estis antaŭpurigitaj per proteinaj G magnetaj bidoj (Life Technologies, Carlsbad, CA) kaj poste kovataj dum la nokto je 4 ° C. kun kontraŭ-SPECC1L aŭ IgG proteino G-proteinaj bidoj estis uzataj por ĉerpi SPECC1L kaj Western blotting estis farita uzante la anti-SPECC1L. -β-catenina antikorpo priskribita supre La kun-IP-eksperimentoj montritaj estas reprezentaj de kvar sendependaj eksperimentoj.
Fiksaj kulturitaj ĉeloj aŭ musaj embriaj histoj estis disponigitaj al la elektronmikroskopiocentro ĉe la Universitato de Kansasa Medicina Centro.Mallonge, specimenoj estis enkonstruitaj en EMbed 812-rezinon (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerigitaj dum la nokto je 60 °C, kaj sekciitaj je 80 nm uzante Leica UC7-ultramikrotomon ekipitan per diamantklingo.Sekcioj estis bildigitaj per JEOL JEM-1400 dissenda elektronmikroskopo ekipita per 100 kV Lab6-pafilo.
Kiel citi ĉi tiun artikolon: Wilson, NR et al.Manko de SPECC1L kondukas al pliigita stabileco de splisitaj artikoj kaj reduktita delaminado de kraniaj neŭralaj krestaj ĉeloj.la scienco.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukto kaj diferencigo de la neŭra kresto.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kraniaj neŭralaj krestoĉeloj en moviĝo: ilia rolo en kraniovizaĝa evoluo.Amerika Ĵurnalo de Medicina Genetiko.Parto A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: ĝia kresko kaj evoluo dum 20 jaroj.Pediatro.patologio.laboratorio.medikamento.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU kaj Noten MM Breakthrough en la genetiko de orovizaĝaj fendoj.Tendencoj en Molekula Medicino 17, 725-733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. kaj Riley, FM Molekulaj mekanismoj de krania neŭra kresta ĉelmigrado kaj strukturizado dum kraniovizaĝa evoluo.Evoluo 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH kaj Murray, JK Fendita lipo kaj palato: kompreni genetikajn kaj mediajn influojn.natura komento.Genetiko 12, 167-178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Nenormala morfogenezo de la haŭto, membroj, kaj kraniovizaĝa regiono en interferon-reguliga faktoro-6 (Irf6)-mankaj musoj.Nacia Genette.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominaj mutacioj en GRHL3 kaŭzas van der Waord-sindromon kaj difektas evoluon de la buŝa peridermo.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ kaj Juriloff, DM Ĝisdatigu la liston de musmutaciuloj kun difektoj en neŭratubfermo kaj progreso al kompleta genetika kompreno de neŭratubfermo.Esploro de denaskaj difektoj.Parto A, Klinika kaj Molekula Teratologio 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediaciita PDGFRalpha signalado reguligas supervivon kaj proliferadon en skeleta evoluo tra p53-dependa intraĉela vojo.Gene Development 28, 1005-1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND kaj Murdoch, JN Disheveled: Rilato de konverĝa vastiĝo al neŭratubfermo.Tendencoj en neŭrologio.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).